急性脑出血模型大鼠脑组织中差异表达基因测序的验证及功能分析

背景:急性脑出血中存在差异表达的基因,这些基因与脑出血发生发展有关。目的:筛选急性脑出血大鼠模型脑组织中差异表达的基因和关键基因,并采用qPCR进行验证,分析关键基因与脑出血后神经功能、脑组织含水量的关系。方法:78只SD大鼠随机分为2组:脑出血组大鼠于右侧尾状核部位注射胶原酶构建脑出血模型,假手术组大鼠于相同部位注射等量生理盐水。运用TRIzol法将2组大鼠的脑组织提取出RNA,转录组测序,筛选急性脑出血脑组织的差异表达的基因,经过qPCR验证,分析基因与脑出血后神经功能、脑组织含水量的关系,并结合生物信息学对关键基因进行GO、KEGG功能富集分析。结果与结论:①筛选出10个关键基因,分别是CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E、CCL20;②脑出血组的关键基因GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E含量低于假手术组(P<0.05),CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、CCL20含量高于假手术组(P<0.05);③关键基因GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E含量与脑组织含水量、神经功能缺损评分正相关(P<0.05),CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、CCL20含量与脑组织含水量、神经功能缺损评分负相关(P<0.05);④GO分析显示基因在生物过程差异表达基因主要富集于白细胞趋化性、趋化因子介导的信号通路;细胞组成差异表达基因主要富集于阳离子通道复合物、离子通道复合物;分子功能差异表达基因主要富集于门控通道活动、离子通道活动;⑤KEGG分析示基因集中于TNF信号通路、谷氨酸能突触、GABA能突触;⑥结论:在脑出血中出现差异表达的基因为CXCL8、SERPINE1、TFPI2、CXCR4、GDA、KCNQ5、ERICH3、SCN3B、CACNA1E、CCL20,这些基因与脑出血后脑组织含水量、神经功能相关,这些基因主要富集在细胞组分、结合功能、细胞突起等相关的生物学功能上。

犊牦牛肾周棕色脂肪组织的发育及其产热相关基因的表达分析

棕色脂肪组织(BAT)作为非震颤性产热(NST)的主要产热器官,在新生动物的寒冷适应中发挥重要的作用。为探究犊牦牛肾周BAT的发育及其产热相关基因的表达,本试验采集1日龄、7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪组织,利用苏木精-伊红染色观察脂肪细胞,利用透射电子显微镜观察脂滴和线粒体的超微结构,利用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测解偶联蛋白1(UCP1)在脂肪细胞的定位、mRNA和蛋白表达水平,以及脂肪转化因子过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)和过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(PGC-1α)基因mRNA表达水平。结果显示,犊牦牛肾周存在2种类型的脂肪细胞,即含有小脂滴和大量线粒体的棕色脂肪细胞以及含有大脂滴和少量线粒体的白色脂肪细胞;与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周白色脂肪细胞的面积和密度均显著增加(P<0.05),棕色脂肪细胞的面积和密度均显著降低(P<0.05);不同日龄犊牦牛肾周棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞质膜上均有UCP1阳性表达,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪细胞中UCP1阳性表达强度均显著降低(P<0.05);与1日龄犊牦牛相比,30日龄犊牦牛肾周脂肪组织中BAT产热相关基因(UCP1、PPARα和PGC-1α)mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结果表明,出生后犊牦牛肾周棕色脂肪细胞数量逐渐减少而白色脂肪细胞数量逐渐增加,且产热相关基因表达水平逐渐降低。该结果为深入探究犊牦牛寒冷适应机制提供了参考资料。

TMEM206基因敲除小鼠小脑组织中差异表达基因的筛选及生物学功能分析

目的筛选TMEM206基因敲除小鼠小脑组织中的差异表达基因并进行生物学功能分析,探讨TMEM206基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备TMEM206基因敲除小鼠,并通过配殖获得TMEM206基因敲除纯合小鼠。选取3只8周龄雌性TMEM206基因敲除纯合小鼠和3只同窝雌性野生小鼠,分离小脑组织并提取总RNA,转录组测序后,使用Cuffdiff(v2.2.1)软件的EBseq算法筛选差异表达基因,并使用DAVID数据库对差异表达基因进行基因属性(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果共筛选出474个差异表达基因,与正常小脑组织相比,TMEM206基因敲除小鼠小脑组织中上调的基因265个、下调的基因209个。GO功能分析结果显示,差异表达基因的表达产物定位于细胞外膜和主要组织相容性复合体Ⅰ类蛋白(MHCⅠ)较多,功能属性主要归类于结合转录因子、脂类分子及抗原分子等;差异表达基因参与的生物学过程众多,如DNA损伤的细胞反应、细胞分化选择、骨质矿化等。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因在分子属性上多为细胞黏附分子和肿瘤坏死因子路径的分子,功能上主要与细胞吞噬和衰老有关,此外还与人乳头瘤病毒、Ⅰ型人类T淋巴细胞白血病病毒、单纯疱疹病毒、Ⅷ型人疱疹病毒及EB病毒等感染有关。结论TMEM206基因敲除后,小鼠小脑组织中筛选得到474个差异表达基因,差异表达基因与维持细胞外膜结构稳定、细胞黏附、病毒感染有关。

组织桥接整合因子1、Ⅰ型胶原蛋白基因、核转运蛋白基因2与三阴性乳腺癌术后复发关系

目的探究组织桥接整合因子1(BIN1)、Ⅰ型胶原蛋白基因(COL1A1)、核转运蛋白基因2(KPNA2)表达与三阴性乳腺癌(TNBC)术后复发关系及联合检测意义。方法选取2019年5月至2020年5月上海市第八人民医院行手术治疗的TNBC病人80例,根据术后2年是否复发分为复发组、未复发组,比较两组临床资料、组织BIN1、COL1A1、KPNA2基因表达,复发的相关影响因素采用单因素与多因素logistic回归分析,组织BIN1、COL1A1、KPNA2基因表达预测术后复发的价值采用受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析,组织BIN1、COL1A1、KPNA2基因表达与复发时间关系采用Pearson分析,比较不同组织BIN1、COL1A1、KPNA2基因表达病人无复发生存期(RFS)。结果复发组T分期、N分期与未复发组比较,差异有统计学意义(P<0.05);复发组组织BIN1mRNA表达为0.24±0.07,低于未复发组的0.35±0.10(P<0.05),复发组组织COL1A1mRNA、KPNA2mRNA表达分别为2.07±0.62、2.91±0.84,高于未复发组的1.48±0.43、1.85±0.60(P<0.05);T分期、N分期、COL1A1 mRNA、KPNA2 mRNA均是复发相关独立危险因素,BIN1 mRNA是复发相关独立保护因素(P<0.05);BIN1 mRNA、COL1A1 mRNA、KPNA2 mRNA的AUC分别为0.76、0.80、0.78,三者联合的AUC为0.94;BIN1mRNA与复发时间呈负相关(r=-0.79,P<0.001),COL1A1mRNA、KPNA2mRNA与复发时间呈正相关(r=0.77、0.78,均P<0.001);BIN1mRNA高水平病人RFS长于低水平病人,COL1A1mRNA、KPNA2mRNA高水平病人RFS短于低水平病人(P<0.05)。结论BIN1mRNA、COL1A1mRNA、KPNA2mRNA与TNBC术后复发风险、复发时间有关,联合检测可作为早期预测术后复发的一个可靠方案,为临床治疗提供重要的参考信息。

早期肺癌患者血浆与肿瘤组织基因突变图谱对比研究

目的:探究早期肺癌患者血浆与肿瘤组织中基因突变图谱差异。方法:收集200例早期肺癌患者新鲜肿瘤组织和血浆样本。肿瘤组织样本直接从患者肺部磨玻璃病变或小结节收集。利用高通量测序(NGS)进行基因测序,采用ATG-Seq系统[包括单分子标签突变跟踪系统(BBAM)、双链对比低频突变解码系统(DDAM)和生信背景抛光纠错系统(BISC)三种优化技术]进行测序。结果:在循环肿瘤DNA(ctDNA)中,某些基因突变的丰度可能低至0.1%,与NGS检测的背景噪音混合,难以区分。ATG-Seq技术有效地编码了ctDNA单分子,大幅度降低了游离细胞DNA(cfDNA)测序的背景噪音。肺腺癌中主要的驱动基因突变包括TP53、表皮生长因子受体(EGFR)等。在早期肺癌患者的cfDNA样本中,血浆cfDNA与肿瘤组织的一致性率较高,且血浆样本中的基因突变检出率低于肿瘤组织样本(均P<0.05)。在肿瘤组织中,EGFR野生型占比为75.00%,EGFR突变型占比为25.00%。在术前血浆中,EGFR野生型占比为6.00%,EGFR突变型占比为94.00%。结论:早期肺癌患者血浆cfDNA遗传谱与肿瘤组织存在较高的一致性,但也有差异。结合两种样本的基因突变信息可为肺癌的早期诊断提供更精确的依据。

早期肺癌患者血浆与肿瘤组织基因突变图谱对比分析

分析早期肺癌患者血浆与肿瘤组织基因突变图谱的对比分析,评价利用血浆对早期肺癌进行辅助诊断的可行性。方法 入组可获取新鲜肿瘤组织及血浆样本的200例早期肺癌患者,患者临床资料齐全且获得知情同意。收集患者的血浆和肿瘤组织样本,经过基因检测后获得基因突变图谱,进行对比分析。结果 组织DNA和ctDNA样本均检测到基因突变,且具有一致性;配对组织DNA与ctDNA检测的准确率平均为65.21%(0-100%),准确率中位值为90.93%。结论 ctDNA检测作为一种疾病诊断和评价肿瘤分子状态的方法,可能有助于早期肺癌的临床诊断和治疗。

合作猪SIRT 3基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆合作猪沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,SIRT3)基因CDS区序列,并对其进行生物信息学分析,探究SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达水平,为研究SIRT 3基因功能奠定基础。【方法】试验选择3月龄合作猪公猪3头,采集心脏、睾丸、肺脏等组织,采用PCR扩增、Sanger测序等方法获取SIRT 3基因CDS区序列,并通过Mega 7.0软件构建系统进化树;通过生物信息学在线软件分析SIRT3蛋白结构和功能;采用实时荧光定量PCR检测SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达量。【结果】合作猪SIRT 3基因CDS区长774 bp,共编码257个氨基酸。系统进化树结果显示,合作猪与家猪亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。SIRT3蛋白的分子质量为28.68 ku,理论等电点为5.81,不稳定系数为37.92,为稳定性亲水蛋白;该蛋白不存在跨膜区域,无信号肽,但存在2个低复杂度结构域,主要分布于内质网中;SIRT3蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构模型预测结果与二级结构基本一致。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT 3基因在合作猪不同组织中均有表达,在心脏中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),其次是睾丸、肺脏、肝脏组织。【结论】本研究成功克隆合作猪SIRT 3基因CDS区序列,探究了SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达水平并初步分析了其编码蛋白的生物学功能,为进一步研究合作猪SIRT 3基因功能提供了参考。

陆川猪MyoD1基因克隆及组织表达分析

为探究陆川猪骨骼肌生长发育过程中MyoD1基因所起作用,对陆川猪成肌细胞决定基因1(MyoD1)进行克隆,展开生物信息学分析,对其在陆川猪不同组织中的表达进行分析,以NCBI上已公布的野猪MyoD1基因序列为模板,进行特异性引物设计,克隆陆川猪MyoD1基因CDS区,并与NCBI已公布的野猪、牛、绵羊、人、小鼠、大鼠基因序列进行相似性比对,由此构建系统进化树,通过在线软件开展生物信息学分析,而后使用实时荧光定量PCR检测在陆川猪不同组织中MyoD1基因的相对表达量。陆川猪MyoD1基因CDS区全长960 bp,共编码319个氨基酸,碱基突变共存在5处,与野猪、牛、绵羊、人类、小鼠、大鼠的MyoD1基因CDS序列相似性分别为99.2%,93.0%,92.3%,90.0%,84.3%,84.0%,其中与野猪相似性最高,表明二者亲缘关系最为接近;陆川猪MyoD1基因原子总数为4680,蛋白的分子质量为33.99 ku,分子式为C_(1457)H_(2296)N_(442)O_(471)S_(14);不稳定系数为63.87,表明其缺乏稳定性;等电点为5.63,属于酸性蛋白;不存在跨膜结构,存在35处磷酸化位点及1处糖基化位点;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比60.69%。陆川猪MyoD1基因在背最长肌中的表达量最高,且显著高于其他组织,表达量最低的组织为肾脏。陆川猪各组织中均有MyoD1基因表达,且主要在背最长肌中表达,由此推测,MyoD1基因在陆川猪肌肉生长发育过程中可能起到至关重要的作用。

牦牛FABP3基因克隆及组织表达谱分析

【目的】分析牦牛心肌脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的结构和功能,并检测其在成年牦牛和胎牛中的表达水平,为探究该基因在牦牛育种中的生物学功能提供理论参考。【方法】以美仁牦牛的心脏组织为试验材料,PCR扩增FABP3基因,对得到的编码区序列(CDS)进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR),检测FABP3基因在成年牦牛和胎牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织的表达水平。【结果】牦牛FABP3基因编码区序列长度为402 bp,编码133个氨基酸;蛋白质的高级结构主要是β-转角和延伸链;牦牛FABP3蛋白不存在跨膜区域和信号肽,属于具有一定亲水性的稳定蛋白;牦牛FABP3基因CDS区核苷酸及其编码氨基酸序列的同源性分析显示,FABP3基因在牛属动物中具有一定的保守性;系统进化树分析表明,牦牛与野牦牛和瘤牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。RT-qPCR结果显示,FABP3基因在成年牦牛和胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织中均有表达,但在胎牛肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中的表达水平显著或极显著高于成年牦牛,在成年牦牛肺脏中的表达水平极显著高于胎牛。【结论】克隆了牦牛FABP3基因,探究了FABP3基因在牦牛中的组织表达规律,为进一步研究该基因在牦牛脂肪沉积中的作用提供了基础数据。

凡纳对虾高低繁殖力群体卵巢组织学观察及相关候选基因的表达分析

在生产中,凡纳对虾(Penaeus vannamei)雌虾的繁殖性能表现出巨大差异。本研究以一个生产周期中雌虾产卵频次为繁殖力指标性状,以高繁殖力和低繁殖力雌虾为研究对象,对雌虾不同卵巢发育阶段(增殖期、小生长期、大生长期和成熟期)进行组织学观察。针对在前期选择清除分析中筛选到的繁殖候选基因TRX2、PARD3、PLCβ4和RERE,在高、低繁殖力雌虾不同卵巢发育阶段,采用实时荧光定量PCR方法,首次分析比较这些基因在卵巢、眼柄组织中的表达规律。组织观察结果显示,低繁殖力雌虾卵巢在整个生产周期中无法发育至成熟期,高繁殖力雌虾卵巢在卵黄颗粒的形成和积累、皮质棒形成等关键过程的速度要快于低繁殖力雌虾。基因表达检测结果显示,在卵巢小生长期和大生长期,TRX2、PLCβ4和RERE基因在高繁殖力组卵巢的表达量均显著高于低繁殖力组卵巢(P<0.05),4个基因在高繁殖力组成熟期卵巢中均维持较高的表达水平;在不同时期的眼柄组织中,低繁殖力组中TRX2、PARD3、PLCβ4和RERE基因的表达量均高于高繁殖力组。研究表明,上述4种基因可能在凡纳对虾卵巢发育过程中发挥重要作用。以上结果为深入研究凡纳对虾雌虾繁殖力产生差异的分子机制以及分子辅助育种提供了重要参考。

美仁牦牛MYL 9基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆美仁牦牛肌球蛋白轻链9(myosin light chain 9,MYL9)基因CDS区并对其进行生物信息学分析,检测MYL 9基因的组织表达特征,为探究该基因功能提供一定理论依据。【方法】以美仁牦牛肌肉组织cDNA为模板,利用PCR扩增并克隆美仁牦牛CDS区序列,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建;通过在线软件对MYL9蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测MYL 9基因在美仁牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中表达情况。【结果】美仁牦牛MYL 9基因CDS区长516 bp,共编码171个氨基酸。系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛、普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远。MYL9蛋白分子式为C 858 H 1324 N 234 O 274 S 12,原子数为2702,理论等电点为4.85,不稳定系数和总平均亲水性分别为37.22和―0.772,属于稳定亲水性蛋白。MYL9蛋白无信号肽和跨膜螺旋结构,属于非分泌性蛋白;主要定位于线粒体、细胞核、细胞质中,具有17个特异性磷酸化位点。MYL9蛋白二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠和延伸链构成,三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,MYL 9基因在美仁牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中均表达,且肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆美仁牦牛MYL 9基因CDS区,探究了MYL 9基因的生物学功能及组织表达特征,研究结果为进一步探究牦牛MYL 9基因功能特征提供了参考。

高低产蛋鸡产蛋后期卵巢组织差异表达基因筛选及其功能分析

本文采用转录组测序技术和生物信息学分析的方法对高低产蛋鸡卵巢组织差异表达基因进行筛选,得到了调控产蛋量的潜在候选基因并对其生物学功能进行分析,探究其在卵巢及卵泡发育过程中的作用。本研究共以3只高产蛋鸡和3只低产蛋鸡卵巢组织为试验对象,以转录组测序技术分析2种蛋鸡卵巢组织中的基因表达情况,采用GO Term和KEGG Pathway方法对筛选得到的差异表达基因进行功能分析。结果发现,在高低产蛋鸡卵巢组织样本中平均获得1.07×10^(8)个Clean Reads,其中比对到参考基因组上的Clean Reads约占93%。与低产蛋鸡卵巢组织相比,高产蛋鸡卵巢组织共有125个显著差异表达基因,其中101个基因显著上调和24个基因显著下调。GO Term分析发现,差异表达基因主要富集在生长、细胞组织成分、细胞组成部分或生物合成以及细胞外基质结构成分等过程;KEGG通路主要富集在焦点粘着、细胞外基质受体相互作用、转化生长因子-β信号通路等途径。对基因表达水平进行综合分析发现,高产蛋鸡卵巢组织中上调基因VCAN、VIPR2、DCN、COL6A2、COL6A1、RELN、FN1、ADAMTS1、COL3A1在卵泡细胞的细胞外基质形成和细胞连接过程中发挥作用,推测这些基因可能在蛋鸡卵巢发育及卵泡选择方面具有调控作用。本研究为分析产蛋后期高低产蛋鸡卵巢组织功能差异及卵泡发育机制提供了新的理论参考。

鸡SLMO2基因CDS区克隆、生物信息学及组织表达分析

为了探究类果蝇慢移基因的氨基酸序列特征,探索其在不同肤色鸡不同组织中mRNA表达变化规律,实验采集不同肤色鸡各组织,PCR克隆获得SLMO2完整CDS区,进行生物信息学分析及组织表达分析。实验得到SLMO2的CDS区序列全长560 bp,其中可编码氨基酸174个。生物信息学研究结果表明,鸡SLMO2蛋白并不具有信号肽和跨膜结构,蛋白主要结构以无规性卷曲的α-螺旋结构结合为主,且蛋白分布在线粒体内膜间隙。通过氨基酸序列对比发现,鸡与爪蟾的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SLMO2在背肤组织中相对表达量极显著高于其他组织,且该基因在丝羽乌骨鸡背肤组织中表达量极显著高于“豫粉1号”H系鸡。以上结果为进一步探究鸡SLMO2对黑色素沉积的调控机制提供了理论依据。

西藏桑桑牦牛FGF1基因克隆及组织表达

为研究牦牛FGF1基因的生物学结构和功能,及其在不同组织中的表达规律,试验以桑桑牦牛心脏组织cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆了FGF1基因的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了FGF1基因在牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脂肪组织中的表达水平。结果表明,桑桑牦牛FGF1基因的CDS区序列长468 bp,共编码155个氨基酸;相似性比对发现,桑桑牦牛与牛和瘤牛的同源性最高(99.8%),与鸡的同源性最低(73.7%);生物信息学分析表明,桑桑牦牛FGF1蛋白的理论等电点为6.51,为酸性亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构,主要定位在细胞核中;该蛋白存在7个糖基化位点和29处潜在的磷酸化位点;蛋白的二级结构主要以无规则卷曲为主,与FGF22、TGFB1和FGF17等蛋白存在主要相互作用。实时荧光定量结果显示,FGF1基因在桑桑牦牛各组织中均有不同程度的表达,其中在肺脏组织中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。

大恒799肉鸡Myoz1基因CDs区克隆、序列分析及其组织表达研究

为研究钙调神经磷酸酶肌小结结合蛋白1(Myoz1)的氨基酸序列特征及其在不同组织器官中的mRNA表达水平,试验通过PCR克隆Myoz1 CDs序列,分别利用ExPASYProt⁃param、ProtScale、Target P、DNAStar Protean、SWISS-MODEL、SignalP 4.1 Server、NetPhos2.0Serv⁃er和STRTNG软件,进行Myoz1蛋白理化特性、亲/疏水性、亚细胞结构、蛋白二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点和蛋白互作分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Myoz1基因表达量。结果显示:大恒799肉鸡Myoz1基因CDs序列全长为881 bp,可编码293个氨基酸;大恒799肉鸡Myoz1基因氨基酸序列与雉鸡、岩雷鸟位于一个分支,同源性最高,均高于96%,亲缘关系最近;Myoz1蛋白为水溶性蛋白且大多分布于细胞核内,分子式为C1442H_(2)244N400O430S10,分子质量约为32384.70 ku,理论等电点为9.12;Myoz1蛋白不存在信号肽,为分泌蛋白,共存在37个潜在的磷酸化位点、1个N-糖基化潜在位点;Myoz1蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构预测结果与其一致;Myoz1蛋白与ACTN2、LDB3、LMOD3等Z盘蛋白(PDZ-LIM结构域蛋白,ZASP)以及肌肉生长发育相关蛋白有相互作用的关系;Myoz1在1日龄大恒799肉鸡胸肌和腿肌的表达量显著高于其他组织,且在胸肌中的表达量高于腿肌(P<0.05)。研究表明Myoz1基因可能在肌肉生长发育过程中发挥调控作用。

电针对运动大鼠腓肠肌组织代谢酶及自噬基因表达的影响

背景:急性运动易引起机体内骨骼肌组织损伤和体内脂代谢紊乱,但急性运动联合电针调控机体内代谢和自噬通路的机制尚不明确。目的:观察电针“足三里”和“环跳”穴对急性运动大鼠骨骼肌代谢酶及自噬水平的变化。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为安静对照组(10只)、模型组(20只)、逆电针组(20只),后两组设2个时相点,即运动后即刻和运动后3 h组,每个时相点10只大鼠。后两组进行适应性跑台运动训练后,进行急性运动训练,逆电针组大鼠于每天跑台训练前先介入电针治疗(参数为电针大鼠两侧“足三里”和“环跳”穴,连续波、频率2 Hz、强度2 mA、留针30 min、1次/d、连续7 d),电针后休息10 min再进行急性运动。分别于运动后即刻和运动后3 h麻醉取大鼠双侧腓肠肌组织,苏木精-伊红染色观察大鼠骨骼肌组织病理学变化;ELISA法检测大鼠骨骼肌组织肝脂酶、脂肪酸合成酶、激素敏感脂肪酶、肉碱棕榈酰转移酶1活性;免疫组织化学和Western Blot法检测自噬基因表达变化。结果与结论:①苏木精-伊红染色后模型组大鼠运动后即刻和运动后3 h腓肠肌纤维排列出现紊乱、肿胀、破裂;逆电针组大鼠运动后即刻和运动后3 h腓肠肌纤维排列紧密,肿胀和破裂的细胞大为减少,与安静对照组比较无明显性差异;②模型组和逆电针组运动后3 h的肝脂酶和脂肪酸合成酶活性均低于安静对照组(P<0.05或P<0.01);模型组和逆电针组大鼠运动后3 h的脂蛋白酯酶、激素敏感脂肪酶和肉碱棕榈酰转移酶1活性高于安静对照组(P<0.05或P<0.01),激素敏感脂肪酶和肉碱棕榈酰转移酶1活性在逆电针组运动后即刻高于模型组同期(P<0.05);与模型组运动后3 h相比,逆电针组运动后3 h脂蛋白酯酶活性升高(P<0.05),激素敏感脂肪酶活性降低(P<0.01);③免疫组织化学结果显示,P62、自噬相关基因5和自噬相关基因7表达在模型组大鼠运动后即刻和运动后3 h及逆电针组运动后即刻均高于安静对照组(P<0.05或P<0.01),其中运动后即刻和运动后3 h逆电针组大鼠P62及自噬相关基因7表达均低于模型组(P<0.05);④Western Blot结果显示,运动后即刻逆电针组大鼠P62和自噬相关基因7蛋白表达均低于模型组(P<0.05);Parkin蛋白表达在模型组大鼠运动后即刻和运动后3 h均高于安静对照组(P<0.05),逆电针组大鼠运动后即刻和运动后3 h均低于模型组(P<0.05);⑤提示急性运动引起大鼠腓肠肌纤维排列出现紊乱、肿胀、破裂,电针两侧“足三里”和“环跳”穴可改善大鼠骨骼肌脂代谢水平及调控自噬细胞,防止急性运动引起大鼠机体内脂代谢紊乱和腓肠肌组织的损伤,其机制可能与调控自噬相关因子P62、自噬相关基因5、自噬相关基因7、Parkin蛋白表达来促进大鼠骨骼肌细胞自噬的发生或调节细胞自噬通路密切相关。

2种抗生素对大黄鱼肠道组织及紧密连接蛋白基因表达的影响

为探究盐酸多西环素和恩诺沙星对大黄鱼肠道结构及肠道紧密连接蛋白相关基因表达的影响,在水温16.80~22.50℃下,将体质量(41.57±1.63)g的大黄鱼饲养在直径1 m、水深1.25 m的圆形塑料水槽中,投喂剂量0、0.2、1.0、2.0 g/kg的药饵5~7 d,停药后1、5、15 d,观察肠道组织形态变化,测定紧密连接蛋白基因Claudin-7、ZO-1和Occludin的相对表达量。试验结果显示:大黄鱼摄食2种药物后,肠道均出现肠绒毛萎缩,组织空泡化等病变,随着给药剂量的增加和给药时间的延长,肠道组织损伤程度逐渐加深,紧密连接蛋白基因表达量持续降低;肠黏膜损伤在停药15 d后仍未恢复至对照组水平,药物剂量越高恢复程度越低;与对照组相比,2种药物高剂量组紧密连接蛋白基因表达量在停药15 d后仍显著低于对照组(P<0.05),其余组无显著差异(P>0.05)。试验结果表明,盐酸多西环素和恩诺沙星以剂量时间依赖方式损伤大黄鱼肠道组织,降低肠道通透性,药物剂量越高,恢复周期越长,在15 d后仍未完全恢复。

赤水乌骨鸡ADSL基因的组织表达特征及其干扰载体构建

【目的】探究赤水乌骨鸡胸肌组织中腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)表达特征及其目的基因的干扰载体构建,为深入研究畜禽组织肌肉中肌苷酸(IMP)的表达规律及ADSL基因影响畜禽风味的机制提供理论参考。【方法】以不同月龄(3、4、5和6月龄)的赤水乌骨鸡(公鸡和母鸡各半)为试验材料,运用实时荧光定量PCR检测不同月龄及不同性别赤水乌骨鸡胸肌组织中ADSL基因的表达情况;同时根据GenBank中鸡ADSL基因mRNA序列(NM_205529.2)设计4对短发夹RNA(shRNA)干扰序列(sh1-ADSL、sh2-ADSL、sh3-ADSL和sh4-ADSL)和1对阴性对照序列(sh-NC)与pGPH1/GFP/Neo载体连接后进行测序,将构建成功的ADSL基因干扰载体转染至成肌细胞,检测并筛选出干扰效率最高的干扰载体。【结果】ADSL基因在不同月龄赤水乌骨鸡胸肌组织中的相对表达量排序为5月龄>4月龄>6月龄>3月龄,赤水乌骨母鸡3月龄母鸡的ADSL基因相对表达量极显著高于公鸡(P<0.01,下同),4月龄母鸡ADSL基因的相对表达量显著高于公鸡(P<0.05),6月龄母鸡ADSL基因的相对表达量极显著低于公鸡;ADSL基因质粒的测序结果显示干扰质粒构建成功,质粒转染后干扰组及阴性对照均可见绿色荧光,空白对照不发光,说明各重组质粒成功转染赤水乌骨鸡成肌细胞;ADSL基因沉默结果显示,sh2-ADSL沉默效果最佳,干扰效率为90.30%。【结论】赤水乌骨鸡胸肌中ADSL基因的相对表达量随着月龄增加表现为先上升后下降的变化趋势;3、4和5月龄赤水乌骨母鸡ADSL基因的相对表达量高于公鸡,随着月龄增加ADSL基因的相对表达量增加,公鸡和母鸡间的差异减小。成功分离提取赤水乌骨鸡成肌细胞,并筛选出RNA干扰效果最佳载体sh2-ADSL,为后续研究ADSL基因调控鸡肉肌苷酸及风味的分子机制提供参考。

藏绵羊PFKM基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在分析藏绵羊PFKM的序列特征、生物信息学及其在不同发育阶段(1日龄、3月龄、1岁龄和3岁龄)肌肉组织中的表达模式。以成年(3岁龄)藏绵羊的背最长肌cDNA为模板,克隆PFKM基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量(RT-qPCR)技术检测PFKM基因在背最长肌、心肌、冈上肌、肱二头肌、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏中的表达情况,并检测不同发育阶段上述组织中PFKM mRNA表达水平的变化。同时,用Western Blot检测不同年龄阶段藏绵羊背最长肌中PFKM蛋白的表达水平。结果表明,藏绵羊PFKM基因的CDS区全长2 556 bp,共编码851个氨基酸,与绵羊参考序列相比存在19个突变位点,与绵羊(98.82%)和山羊(98.59%)具有较近的亲缘关系;预测PFKM蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,主要分布在细胞质中,蛋白的二级结构以α-螺旋为主,PFKM蛋白与10个糖酵解相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用;RT-qPCR结果显示,随着年龄的增加,PFKM mRNA在藏绵羊各组织中基本呈现先上升后下降(1日龄<3月龄<1岁龄>3岁龄)的表达趋势,背最长肌中PFKM蛋白的表达也先上调后下调。本研究获得了藏绵羊PFKM基因完整的CDS区,发现其在物种间的保守性较高,并在藏绵羊肌肉生长发育过程中发挥重要的作用。

基于转录组测序的菜心茎尖组织开花相关基因差异表达分析

【目的】基于转录组测序数据分析鉴定调控菜心抽薹开花相关的候选基因及信号通路,为今后阐明菜心抽薹开花调控分子机制及选育不同熟性菜心品种提供理论参考。【方法】对四九-19号(早熟型)和80天油绿(晚熟型)菜心的七叶期和现蕾期茎尖组织进行转录组测序,比较不同熟性菜心品种间及不同生长时期间的差异表达基因(DEGs),并对其进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析,结合FLOR-ID和UniProt数据库筛选出不同熟性菜心参与调控抽薹开花时间的候选基因及信号通路,通过实时荧光定量PCR验证转录组数据的可靠性。【结果】菜心茎尖组织转录组测序数据为81.93 Gb,经质控过滤后得到536679570条Clean reads,GC含量为47.24%~47.63%,Q20为97.11%~98.00%,Q30为91.97%~94.11%,平均87.98%的Clean reads比对上参考基因组。四九-19号菜心的七叶期和现蕾期间有1965个DEGs,80天油绿菜心的七叶期和现蕾期有6007个DEGs。GO功能注释结果显示,涉及分子功能的DEGs最多,主要注释为蛋白质二聚化活性、血红素结合和四吡咯结合等;其次是生物学过程,主要注释为小分子代谢过程、脂质代谢过程和离子运输等过程;细胞成分类别中,DEGs主要注释为核糖体、细胞器部分、染色体、核小体、蛋白质-DNA复合物和DNA包装复合体。KEGG信号通路富集结果显示,四九-19号菜心七叶期和现蕾期间的DEGs显著(Padj<0.05,下同)富集在光合生物中的碳固定及角质、木栓质和蜡生物合成等通路;80天油绿菜心七叶期和现蕾期间的DEGs显著富集在苯丙素生物合成、DNA复制和植物激素信号转导等通路。四九-19号和80天油绿菜心品种间有750个DEGs,其中16个为开花相关基因,涉及光周期途径、自主途径、赤霉素途径、春化途径、温度途径和年龄途径等,部分开花基因在2个菜心品种中表达量存在明显差异。实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果相关性较强。【结论】菜心抽薹开花过程受到光周期途径、自主途径和赤霉素途径等关键途径调控,同时受到春化途径、温度途径和年龄途径的影响。虽然2个不同熟性菜心品种开花调控所涉及的途径基本相同,但开花调控途径中的基因响应不一致,导致二者开花时间存在差异。