雌酮硫酸钠的制备及其对小鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究

目的研究雌酮硫酸钠(Estrone sulfate sodium,ES)的制备方法及其对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法(1)采用雌酮和氨基磺酸通过氨基磺酸化和离子置换法合成ES。采用核磁共振内标法计算ES的纯度,采用紫外光谱法、红外光谱法、高分辨质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱对ES进行结构分析。(2)建立雌鼠更年期模型,将小鼠随机分为溶媒组(蒸馏水0.094 mg/kg体重)、雌二醇组[(Estradiol,E2),给药剂量0.3 mg/kg体重]和ES组(给药剂量0.094 mg/kg体重)灌胃给药2周后建立小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测量心梗面积,评估ES预处理对小鼠心肌损伤的影响。结果合成的ES纯度为66.6%,Tris含量30.8%,表征结果显示产物为雌酮硫酸钠。与溶媒组比较,E2降低小鼠心肌缺血/再灌注损伤面积,但是E2组差异不具有统计学差异,而ES组小鼠心肌缺血/再灌注损伤导致的心肌梗死面积减少,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论本合成方法能够得到纯度较高且稳定的ES,动物试验结果证明ES能够减少小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心肌梗死面积。

固相萃取-高效液相色谱法测定结合雌激素乳膏中主要成分含量

采用固相萃取-高效液相色谱法(SPE-HPLC)测定结合雌激素乳膏中雌酮硫酸钠(Es)和马烯雌酮硫酸钠(Eqs)的含量。色谱柱为Agilent C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-0.025 mol·L^-1 KH2PO4(1∶3,体积比),流速1.0 mL·min^-1,柱温35℃,检测波长205 nm,进样量20μL。结果表明,Es在6.89~220.5μg·mL^-1浓度范围内线性关系良好(R2=0.9996),Eqs在4.5~144.3μg·mL^-1浓度范围内线性关系良好(R2=0.9999);Es和Eqs峰面积RSD分别为0.15%和0.19%,结合雌激素含量RSD为1.25%(n=6),标示量80%、100%和120%的Es和Eqs的平均加标回收率分别为105.32%、103.10%、105.81%和95.15%、96.81%、96.37%。该方法准确度高,精密度和灵敏度均能满足测定要求,为结合雌激素乳膏质量控制提供了科学依据。

孕马尿中雌酮硫酸钠单克隆抗体的研制

目的建立雌酮硫酸钠(ESS)单克隆抗体的制备方法。方法以ESS为抗原免疫Balb/c小鼠,筛选小鼠免疫方法,并通过方阵滴定法确定间接酶联免疫吸附测定(ELISA)方法;再以杂交瘤抗体技术获得抗ESS单克隆抗体细胞株。结果 ESS抗原5次以初次免疫200μg,加强免疫100μg的免疫剂量多点注射小鼠背部皮下免疫为小鼠最佳免疫方法;确定10μg·L-1为抗原包被浓度,1∶2 000的一抗血清稀释倍数;细胞融合率达90.2%,ELISA法筛选阳性率为4.4%,并筛选得到两株特异性较好的细胞株2C8和8A7。结论该研究筛选建立了ESS小鼠免疫方法及灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于ESS单克隆抗体的制备及检测,且建立了ESS单克隆抗体制备方法。

近红外光谱技术快速测定孕马尿中雌酮硫酸钠的含量

目的建立近红外光谱技术快速测定孕马尿中雌酮硫酸钠含量的方法。方法采用SupNIR-2600型近红外光谱仪采集孕马尿的光谱数据,用高效液相色谱法(HPLC)测定110个孕马尿样品中雌酮硫酸钠的含量作为参考值。根据HPLC法含量测定结果,划分为校正集样品88个,验证集22个,结合偏最小二乘法,建立孕马尿中雌酮硫酸钠近红外光谱定量校正模型。结果采用二阶卷积求导的光谱预处理方法,选择1000~1799 cm^-1波段进行孕马尿中雌酮硫酸钠近红外光谱定量校正模型的建立,主成分因子数为3,内部交叉验证决定系数为(R2)为0.9443,校正标准偏差(SEC)为1.77,交互验证校正标准偏差(SECV)为4.16。预测集样品平均相对偏差为1.45%。结论该方法快速、准确、简便,可以用于孕马尿中雌酮硫酸钠含量快速测定。

新疆孕马尿中主要结合雌激素定性定量方法研究

目的:建立孕马尿中主要结合雌激素的定性定量方法。方法:孕马尿样品通过HPD-400大孔树脂固相萃取处理后,采用银化硅胶薄层色谱法快速鉴别孕马尿中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-二氢马烯雌酮硫酸钠3种主要结合雌激素;采用merck整体化柱分离,测定样品中3种主要结合雌激素含量。结果:薄层色谱中,供试品色谱与对照品色谱在相应位置显相同颜色的条带,条带清晰,分离效果好,阴性无干扰;建立的含量快速测定方法,3种主要结合雌激素在10min内可达到完全分离,浓度分别为0.8～6.4μg·mL-1(r=0.9996),0.4～3.2μg·mL-1(r=0.9998),0.3～2.4μg.mL-1(r=0.9998)线性关系良好,平均回收率分别为96.1%,96.5%,98.2%。结论:该方法快速、准确、可靠,适合孕马尿中主要结合雌激素的定性、定量检测,对于孕马尿品质评价具有参考价值。

建立雌酮硫酸钠胶体金免疫层析快速限量检测方法

目的:建立一种快速检测孕马尿中雌酮硫酸钠的胶体金免疫层析试纸方法。方法:采用化学合成法将雌酮制备为ESS-17-肟(半抗原),应用混合酸酐法将ESS-17-肟与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备为ESS-17-肟-BSA(免疫原),对所得偶联物溶液进行紫外扫描鉴定并计算偶联率。ESS-17-肟-BSA免疫BALB/C小鼠,取血清高滴度小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,用ELISA法进行阳性筛选。获得阳性克隆细胞株后于BALB/C小鼠体内诱生腹水制备单克隆抗体,抗体纯化后用胶体金标记,通过正交设计确定最佳实验参数,研制出雌酮硫酸钠胶体金免疫层析试纸条。结果:获得经化学结构修饰后的目标抗原ESS-17-肟-BSA,融合克隆后得到4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株2D1、7G4、5F3、2A7,其中2D1抗体纯化后特异强,效价达1.0×10~6。该抗体制备的胶体金层析试纸条的检测限为1μg·L^(-1),与结构类似物均无交叉反应,此法检测样品结果与高效液相色谱法测定结果比对阳性符合率为85.45%(45/52),阴性符合率为89.58%(43/48),总符合率为88.00%(88/100),结果一致性较好。结论:本研究制备了雌酮硫酸钠免疫原,融合制得抗雌酮硫酸钠特异性单克隆抗体,并研制出以雌酮硫酸钠单克隆抗体为基础的胶体金免疫层析试纸条,能够快速、灵敏地检测孕马尿中的雌酮硫酸钠。

雌酮与雌酮硫酸钠双抗夹心检测法的建立及验证比较

目的 建立雌酮和雌酮硫酸钠的双抗体夹心酶联免疫定量检测法,分别与高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）比对检测孕马尿中雌激素的含量,依据其符合性探讨雌酮C3位与雌酮硫酸钠C17位衍生物所得抗体的特异性.方法 由已制备的雌酮C3位与雌酮硫酸钠C17位衍生物分别免疫动物获得相应的单克隆抗体与多克隆抗体,分别建立各自的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法,鉴定其灵敏度、特异性、于现场测定样本,结果与HPLC结果比对. 结果 雌酮、雌酮硫酸钠衍生物小鼠单克隆抗体最佳稀释度为5 μg/mL、2.5 μg/mL,酶标多克隆抗体1∶3 000、1∶2 000,灵敏度0.515 μg/mL、0.365 μg/mL.两项结果雌激素含量与HPLC测定孕马尿中雌激素总含量呈曲线对应,但与单体含量不一致.结论 在方法学上成功建立了两种双抗体夹心ELISA法,实际应用中没能达到实验设计要求,但由此结果推断可能为制备两种雌激素衍生物时都将结构中的特征官能团进行了改造,使得制备出的抗体不能识别特征位点而致特异性不好,需要下一步实验再确定.