马铃薯软腐病菌Erwinia carotovora subsp.carotovora 714种胞外酶基因的克隆和原核表达分析

以马铃薯软腐病菌Erwinia carotovora subsp.carotovora71(Ecc71)为材料,利用同源克隆技术克隆软腐病果胶酸盐裂解酶(pel)、多聚半乳糖醛酸酶(peh)、纤维素酶(cel)和蛋白酶(prt)基因,对其进行生物信息学分析,并将其克隆到原核表达载体pET28a中,将重组载体pET28a-pel、pET28a-peh、pET28a-cel和pET28a-prt转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定和酶活测定,得到了与理论推算的pel、peh、cel和prt基因表达产物分子质量相符的特异条带,并且其酶活性分别为1.672U·mL-1·h-1和0.024、112.7、16.95U·mL-1·min-1。这些结果为今后探究这4种酶之间的相互作用及马铃薯抗病性研究奠定了基础。

花魔芋软腐病原真菌分离鉴定

魔芋软腐病是魔芋生产过程中的重要病害,也是限制魔芋产业发展的主要因素。目前,已有报道魔芋软腐病主要由细菌引起,鲜有真菌引起魔芋球茎软腐发病的报道。为明确云南曲靖市花魔芋(Amorphophallus konjac)软腐病的病原种类和侵染特征,该研究通过组织分离法,对采集自云南曲靖市的花魔芋病样进行了真菌的分离,通过形态学结合基于ITS与LSU序列分析的分子鉴定方法对分离真菌进行鉴定,并根据柯赫氏法则进行致病性测定,并对鉴定出的病原真菌同魔芋软腐病原细菌进行了双回接试验分析。结果表明:(1)从形态学和分子水平鉴定了轮纹镰刀菌(Fusarium concentricum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和F.ambrosium 3种镰刀菌,1种毛霉属真菌(Mucor sp.),1种根霉属真菌(Rhizopus sp.),1种青霉属真菌(Penicillium sp.)和1种粉红螺旋聚孢霉属真菌(Clonostachys sp.)。(2)统计分析发现,轮纹镰刀菌的相对丰度最高,为45.45%。(3)柯赫氏法则检测发现轮纹镰刀菌具有致病性。(4)轮纹镰刀菌和病原细菌胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)双接种魔芋球茎发现软腐病发病更快,病变组织重量显著高于单接种轮纹镰刀菌或果胶杆菌处理。综上表明,魔芋软腐病可能是由真菌和细菌复合侵染引发。该研究结果为魔芋软腐病的防治提供了理论依据。

六盘水地区魔芋软腐病病原菌鉴定及侵染特性研究

软腐病是魔芋栽培中危害最为严重的病害之一。为了明确引起六盘水地区魔芋软腐病的病原菌种类及其侵染特性,从7个魔芋产区采集病害材料,对分离到的16株病株病原菌进行形态学观察、16S rDNA分子生物学、生理生化、生物学特性和侵染特性分析。结果表明,16株病株的病原菌为海芋果胶杆菌(Pectobacteriumaroidearum)和方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai),其中P.aroidearum分离率高达81.25%,是六盘水地区魔芋软腐病主要病原菌;2种病原菌对魔芋叶柄和叶片的侵染速度快于球茎,同时还能引起番茄、甘薯、胡萝卜、西葫芦、马铃薯和萝卜等植物组织腐烂;D.fangzhongdai在28~35℃范围内能快速增殖和侵染魔芋,最适生长和侵染温度为30℃,P.aroidearum在20~30℃时增殖和侵染最快,最适生长和侵染温度为28℃。

Cu^(2+)对软腐细菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora Dye)致病因子的影响

在体外测定中,cu^(2+)浓度高于1.25ppm 时,所有的 StEcc-12菌体(10~6CFU/ml)均被杀死。在以聚半乳糖醛酸为唯一碳源的培养基中,Cu^(2+)浓度高于0.31ppm 时,该细菌不能生长。但较低浓度的 Cu^(2+)能使细菌胞外果胶裂解酶(PL)、果胶水解酶(PG)和蛋白酶的单位活性提高。在细菌胞外酶粗提液中加入2.54ppmCu^(2+)可以大大提高PL 的活性。用50ppm 硫酸铜处理接过菌的薯块可使其中活菌减少2个数量级,但残留下来的细菌仍能迅速繁殖,并导致薯块腐烂。硫酸铜渗透薯块后使各部位的组织含 Cu^(2+)量有不同程度的提高,而以皮孔组织最显著。Cu^(2+)的杀菌作用是减轻软腐病发生的主要原因。

贵州魔芋软腐病菌多基因分子鉴定及其致病力分析

为明确贵州魔芋软腐病菌种类、致病力及分布特点,采用组织分离法对贵州主要魔芋种植区软腐病样进行病原菌分离,对icdA,mdh,mtlD,proA,rpoS等5个管家基因进行了扩增、序列测定,分别用单基因和多基因联合系统发育树对病菌进行鉴定,同时采用组织块接种方法测定了不同菌株的致病力。通过组织分离法共分离魔芋软腐病菌株47株;采用5个管家基因进行分子鉴定,将病菌分别鉴定为海芋果胶杆菌Pectobacterium aroidearum、胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovorum和方中达迪基氏菌Dickeya fangzhongdai 3个种,其中海芋果胶杆菌P.aroidearum为贵州魔芋软腐病主要致病菌,占分离菌株的70%,广泛分布在多个地区;其次为方中达迪基氏菌D.fangzhongdai,占分离菌株的28%,也普遍存在于贵州各魔芋种植区;胡萝卜果胶杆菌P.carotovorum最少,占分离菌株的2%。致病力测定结果表明,菌株间致病力存在一定的差异,其中海芋果胶杆菌不同菌株之间致病力差异较大,低、中、高致病力菌株都有,方中达迪基氏菌差异较小,仅有中、高致病力菌株。本研究确定了贵州魔芋软腐病菌种类、致病力及在贵州的分布特点,首次报道了海芋果胶杆菌、方中达迪基氏菌是贵州魔芋软腐病的主要病原菌,进一步加深了对魔芋软腐病及其发生流行的认识,为软腐病的科学防控提供了科学依据。

四川大白菜细菌性软腐病新病原菌Pectobacterium versatile的鉴定

为明确引起四川理县大白菜软腐病的病原菌种类,从理县梭罗沟村田间采集具有典型软腐症状的大白菜病样,采用组织分离、致病力测定、生理生化分析、形态学和分子生物学方法进行鉴定。结果表明,分离获得的5株细菌在NA培养基上形成的菌落呈圆形、半透明、乳白色、中心突起、边缘平滑,在半选择性培养基CVP上培养48 h后产生凹陷。5株菌均能使大白菜、胡萝卜、马铃薯和芹菜的离体组织腐烂,接种于白菜苗后叶片呈湿腐萎蔫症状。通过大白菜叶柄接种部位形成的病斑长径来比较菌株致病力强弱,各菌株的致病力有显著差异。基于看家基因pgi、rpoS、mdh、proA、mtlD和icdA(NCBI登录号为OL963562~OL963571)的多基因联合系统发育树,分离菌株与Pectobacterium versatile聚为一簇,dnaX-leuS-recA(NCBI登录号为OL963572~OL963576)的多位点序列分析(MLSA)进一步支持以上结果,且准确性更高。分离菌株的生理生化特征与P.versatile模式菌株一致,综上将其鉴定为P.versatile。这是我国首次报道P.versatile引起大白菜软腐病。

拮抗链霉菌26B的筛选及其在不同含水量土壤中对白菜软腐病的防病效果

为挖掘防治白菜软腐病的生防菌,本研究采用牛津杯法从38株白菜根际放线菌中筛选到一株拮抗放线菌26B,通过形态学观察和16S rRNA基因序列分析将菌株26B初步鉴定为链霉菌。该菌除菌发酵滤液对供试的白菜软腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliensis BC1及3种马铃薯黑胫病菌均表现较高的抑菌活性,其中对白菜软腐病菌抑菌直径达到23.97mm。萌发试验表明,白菜种子经26B除菌发酵滤液浸种后发芽势、发芽指数、根长及鲜重显著增加。采用浸根法测定菌株26B除菌发酵滤液对软腐病菌荧光标记菌株BC1-gfp在白菜根部定殖量的影响,浸根处理后48h,白菜根上BC1-gfp的数量达到2.3×109CFU/g;未从26B除菌发酵滤液与BC1-gfp菌悬液混和处理(体积比10%)的白菜根上检测到病原菌。盆栽防病试验结果表明,在含水量为14%和20%的土壤中,菌株26B除菌发酵滤液对白菜软腐病的防效分别达96.0%和89.8%。上述结果表明,链霉菌26B是一株具有潜在开发应用价值的生防菌株,将链霉菌26B应用与土壤水分管理相结合可进一步提高其防病效果。

蔬菜软腐病菌广谱拮抗细菌菌株筛选鉴定及防效研究

为获得广谱高效拮抗蔬菜软腐病菌的生防菌株,本研究以白菜软腐病菌Pectobacterium carotovorum BC2、圆葱软腐病菌Burkholderia gladioli YC1、娃娃菜软腐病菌Pseudomonas sp.WWC2为靶标,采用梯度稀释法及抑菌圈法从蔬菜根际土中分离筛选拮抗菌株。通过形态、生理生化和16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,明确生防菌株种属地位,并研究了菌株生长特性,利用牛津杯法测定生防菌株对3株软腐病菌及3株人源性病原细菌抑菌作用,采用平板对峙法测定其对8株植物病原真菌的抑菌作用,采用针刺接种法测定其对蔬菜离体叶片和田间的防效,并利用X-gal显色法测定其对白菜软腐病菌群体感应信号因子的降解活性。通过研究菌株生长特性、对白菜软腐病菌群体感应信号因子的降解活性、抑菌谱以及对白菜软腐病的田间防效。结果表明,从20个土样分离的1012个细菌中,筛选出18株拮抗菌,其中筛选出1株对3种软腐病菌YC1、BC2、WWC2均有抑菌活性的生防菌株DJ1,其抑菌圈直径分别为(10.60±0.20)mm、(6.92±0.56)mm和(3.92±0.16)mm。经鉴定菌株DJ1为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。菌株DJ1最适生长温度为30℃,具有较好的耐盐性,能在1%-5%NaCl条件下生长,具有一定降解白菜软腐病菌群体感应信号因子的能力,能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和8种植物病原真菌生长,1×10^(8) CFU/mL菌液浓度对白菜、圆葱、娃娃菜软腐病离体防效分别为84.30%、60.21%和69.96%,对白菜软腐病田间防效为79.91%。因此,贝莱斯芽孢杆菌DJ1在防治蔬菜软腐病方面具有潜在应用潜能。

中国半夏主产地软腐病致病菌分离、鉴定及比较研究

【目的】明确中国半夏主产区软腐病病原菌种类及其致病力强弱,为半夏生产和病害防控提供理论依据。【方法】对全国半夏主产区软腐病危害情况进行调查,根据柯赫氏法则对全国半夏主产区软腐病病原菌进行分离、鉴定、致病性检测以及生物学特性研究,并通过离体叶片和离体块茎回接对分离鉴定得到的3种软腐病优势病原菌进行致病力比较分析,采用抑菌圈法对3种软腐病优势致病菌进行室内药剂筛选。【结果】中国半夏软腐病主要由果胶杆菌属(Pectobacterium)的胡萝卜软腐果胶杆菌(P.carotovorum,P.aroidearum)以及狄克氏菌属(Dickeya)的D.fangzhongdai引起,其中P.carotovorum和P.aroidearum分布较广,在全国4个半夏主产区中均可检测到,而D.fangzhongdai仅存在于湖北天门半夏产区。菌株致病力强弱为P.carotovorum>D.fangzhongdai>P.aroidearum,且P.carotovorum、D.fangzhongdai和P.aroidearum更容易从半夏叶片背面进行侵染。在不同条件下培养3种软腐病菌株,结果表明最适生长温度为28~30℃,最适pH为8.0。室内药剂筛选结果表明,26种不同类型杀菌剂中化学杀菌剂噻霉酮、二氯异氰尿酸钠和植物源杀菌剂乙蒜素对3种半夏软腐病优势致病菌株有显著抑制效果,EC_(50)值均小于50μg/mL。【结论】半夏软腐病主要致病菌有P.carotovorum、P.aroidearum和D.fangzhongdai,且P.carotovorum菌株致病力最强,噻霉酮、二氯异氰尿酸钠和乙蒜素对3种半夏软腐病有显著抑制效果。

珠芽黄魔芋软腐病病原菌分离与鉴定

为了对引种驯化的珠芽黄魔芋软腐病病害进行有效防控,采集陕西省镇巴县有软腐病发病症状的珠芽黄魔芋叶柄进行病原细菌分离纯化、致病性检测、分离菌株的菌落形态特征观察、生理生化特征及16S rDNA序列比对分析。试验结果表明,从软腐病症状的珠芽黄魔芋叶柄中分离获得了不同形态的15株细菌,致病性试验发现其中的ZYH1菌株可使珠芽黄魔芋、花魔芋、胡萝卜和白菜离体组织表现出软腐症状,并导致珠芽黄魔芋和花魔芋植株发病。分离的ZYH1菌株单菌落圆形突起,乳黄色,边沿光滑整齐,杆状菌体,16S rDNA序列分析结果表明,该菌株与已报道的胡萝卜软腐果胶杆菌(%Pectobacterium carotovorum)%亲缘关系最近,相似度为99.6%。这是陕南地区首次报道由胡萝卜软腐果胶杆菌引起的珠芽黄魔芋软腐病害,该研究结果有助于为引种驯化的珠芽黄魔芋软腐病害防治提供理论依据。

彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

近几年南京种植的彩色马蹄莲软腐病发生严重,从不同品种的彩色马蹄莲不同部位病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorasubsp.carotovora,P.c.c)。信号分子检测结果表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子。利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌中的attM基因,其编码的AttM解酯酶可以显著降解AHLs,在离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性,这为有效控制彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径。

猕猴桃软腐病主要病原菌的分离、鉴定及其生长特性研究

为探究猕猴桃果实采后软腐病害的主要病原菌及其生长特性,2017年9月于湖南凤凰县猕猴桃基地采集具有软腐病症状的100个果实病样,取患病猕猴桃病健交界处果肉,进行病原菌的分离纯化、菌株形态学观察、病原菌的分子生物学鉴定试验,同时分析不同培养基、碳源、氮源、温度和pH值对病原菌生长的影响。结果表明,菌种鉴定为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和间座壳菌(拟茎点霉菌有性态,Diaporthe phaseolorum)。两种菌在PSA、YPGA、PDA、SDA培养基的生长速度均较快,葡萄座腔菌和间座壳菌生长速率分别在16.1~18.6 mm·d^-1和13.9~16.5 mm·d^-1之间,且菌丝密度均较稠密。淀粉、蔗糖和麦芽糖作为碳源时,病原菌生长效果较好,葡萄座腔菌和间座壳菌生长速率分别在15.9~17.7 mm·d^-1和12.4~16.4 mm·d^-1之间。酵母粉、蛋白胨、甘氨酸作为氮源时,较适宜葡萄座腔菌和间座壳菌生长,两病原菌生长速率分别在11.0 mm·d^-1左右和9.5 mm·d^-1左右,但较未添加氮源培养基仅提高了7%左右。此外,葡萄座腔菌和间座壳菌的最适pH值为5~7,最适温度为25~30℃,菌种致死温度为85℃左右。本研究结果对猕猴桃软腐病病原菌的鉴定及对猕猴桃贮藏过程中软腐病害的绿色防控提供了参考。

西葫芦软腐病病原的初步研究

2004～2006年,在山东省的临淄、聊城、寿光、临沂等12个县市保护地栽培的西葫芦中发现一种严重危害茎基部的细菌性病害。从22批次55株西葫芦病株标本中,经分离纯化获得135个菌株,从中选出部分菌株按柯赫法则对其进行致病性测定,均产生与田间相同症状。对病原菌形态、染色反应、培养性状和生理生化等几项试验结果表明,病原菌为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwinia carotovora subsp.carotovora。

魔芋软腐病病原菌的分离及致病性研究

自贮藏期腐烂的魔芋球茎和有典型软腐病害症状特性的植株分离出的菌株 ,通过形态特征、生理生化特性及致病性研究 ,结果表明 :3号、4号菌株为魔芋软腐病病原菌 -胡萝卜软腐欧氏杆菌 (Erwiniacarotovorasubsp .carotovora) 。

滇重楼茎秆软腐病病原鉴定

【目的】明确滇重楼茎秆软腐病的病原,以期为该病的防治提供依据。【方法】通过田间调查采样,初步掌握滇重楼茎秆软腐病的发生规律,通过稀释分离、柯赫氏法则验证获得病原菌,基于形态特征和16S r DNA、gyr B、rpo B基因序列特征对病原菌进行鉴定。【结果】从发病植株上分离出1株细菌,经柯赫氏法则验证为滇重楼茎秆软腐病病原菌,基于形态和分子生物学特征将其鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum。【结论】胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种P.carotovorum subsp.carotovorum是滇重楼茎秆软腐病的病原菌。

云南香蕉细菌性软腐病病原鉴定

为了明确引起云南香蕉细菌性软腐病的病原菌,为该病害防控提供基础,在植蕉区采集香蕉细菌性软腐病病害标样,对病原菌进行分离、致病性测定、寄主范围测定、形态学观察、生理生化反应及16S r DNA序列分析。结果表明:分离获得的菌株均有致病性,病原菌形态特征、寄主范围、生理生化测定结果与Erwinia chrysanthemi相符。16S r DNA序列分析表明:代表性菌株的测序结果与E.chrysanthemi(序列登录号:GU811708)的同源性达到99%以上,系统发育树分析结果与之一致,表明引起云南香蕉细菌性软腐病的病原菌为菊欧氏杆菌(E.chrysanthemi),该病害是近年来发生在云南植蕉区的一种新病害。

香蕉细菌性软腐病菌致病性分化和遗传多样性分析

目的:研究广东香蕉细菌性软腐病菌Dickeyaparadisiaca的致病性差异和遗传多样性.方法:采用香蕉假茎离体接种法和幼苗盆栽接种法对分离自广东香蕉的13个菌株进行致病性分析;利用16S-23SrDNA转录间隔区PCR(ITS-PCR)和细菌基因组的重复序列PCR(Rep-PCR)技术,对供试菌株的遗传多样性进行研究.结果:采用2种不同的接种方法,供试菌株致病力均可划分为强(++++)、较强(+++)和中等(++)3种致病型,2种方法得到的结果基本一致,且与菌株的地理来源有一定的相关性;利用ITS-PCR扩增,可将供试菌株划分为6个组群;而利用细菌基因组重复序列通用引物BOX和J3进行Rep-PCR扩增,在遗传距离为0.52时,供试菌株可被划分为2个遗传相似组,其中组1为主要组群;在遗传距离为0.65时,供试菌株可被划分为4个遗传相似组,其中组3和组4为主要组群.结论:侵染广东香蕉的细菌性软腐病菌存在明显的致病性分化和丰富的遗传多样性.

甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原鉴定

结合形态学与分子生物学特征对甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原种类进行了鉴定,在KB培养基上对两株典型菌株的菌落形态和培养特征进行了观察和描述,16SrDNA序列测定和同源性比对结果表明两菌株的16SrDNA序列分别与GenBank数据库已知胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和格氏沙雷氏菌的序列同源性均达99%,其片段大小分别为1 386bp和1 379bp。致病性测定结果表明,2种菌均能引起洋葱鳞茎软腐病,且洋葱基部的发病程度高于顶部,其中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的致病力强于格氏沙雷氏菌。按柯赫氏法则初步确定甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原种类为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和格氏沙雷氏菌2种,由格氏沙雷氏菌引起的洋葱鳞茎软腐病属首次报道。本研究将为洋葱软腐病的防治提供理论依据。

软腐欧文氏菌致病性的研究进展

由Ecc,Ech,Eca三种主要病原菌引起的软腐病是世界农业生产上危害很严重的病害之一。目前,对软腐欧文氏菌与植物的互作在世界范围内的大量研究,已经为深入揭示其致病的分子机理提供了有效帮助,并将为软腐病的有效防治提供新的思路和手段。文章将就软腐欧文氏菌的重要致病因子、致病过程中病原菌与植物的基因表达等作综述。

入境马蹄莲细菌性软腐病菌的分离鉴定

目的在参展青岛世界园艺博览会的荷兰进口马蹄莲植株上,发现叶片有明显褐色软腐症状,为明确引起马蹄莲软腐病的病原,对叶片进行病菌的分离鉴定。方法采用组织分离法,从荷兰入境马蹄莲植株的病变叶片中分离纯化到2株致病性细菌菌株(MTL1、MTL2),对该菌株进行鉴定和生物学特性研究。结果形态及培养特征、生理生化特性的研究结果表明该菌株在NA培养基上能形成白色圆形单菌落,薄而平滑、边缘整齐,光滑不透明,KB培养基上划线培养后可产生明显的绿色的荧光。显微镜下菌体呈杆状,具多根极生鞭毛,革兰氏阴性菌。结论经形态鉴定、培养特征、生理生化及16S r DNA序列分析和致病性测定实验,确认引起马蹄莲细菌性软腐病的病原为边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)。