人体中可溶性VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

针对人体血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEG-FR-2)受体型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达,并对表达和纯化条件进行优化。构建表达VEGFR-2酪氨酸激酶重组大肠杆菌,通过研究不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和超声条件等对蛋白表达的影响,采用Ni-NTA亲和层析法、Western Blot法ELISA方法对重组蛋白进行纯化、鉴定和活性测定。成功地将1 000 bp左右的VEGFR-2酪氨酸激酶DNA片段插入载体pQE30中,在优化条件下重组蛋白较好地可溶性表达。SDS-PAGE表明重组蛋白相对分子质量约为36 000,与预期一致,Western Blot分析表明它能与抗Flk-1和抗His抗体特异反应,ELISA检测结果表明重组蛋白具有利用ATP催化底物磷酸化的激酶活性。通过重组DNA技术使人体VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌得到可溶性表达,纯化重组蛋白具有较高的活性。

芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠Ang-1、Ang-2/Tie-2的影响

目的:观察芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠肝组织Ang-1、Ang-2/Tie-2的影响.方法:应用CCl4复制大鼠肝纤维化模型,同时给予芪术颗粒灌胃预防,并设立空白对照组、模型对照组、鳖甲软肝片对照组,分别于造模4wk后取大鼠肝组织,实时荧光定量PCR方法检测Ang-1、Ang-2/Tie-2mRNA的表达量.结果:芪术颗粒组Ang-1mRNA表达量明显低于模型组(0.32±0.11vs0.66±0.80,P<0.01),而Ang-2mRNA的表达量明显高于模型组(0.27±0.34vs0.09±0.01,P<0.05).芪术颗粒组和鳖甲软肝片组比较,二者对Ang-1、Ang-2及Tie-2mRNA表达的影响无显著差异.结论:芪术颗粒通过调控Ang-1、Ang-2/Tie-2mRNA的表达,阻断肝窦毛细血管化的形成以减少肝纤维化的产生.

sFlt-1与LAMP-2在ANCA相关性肾炎患者血清中的表达水平及其相关性分析

目的探究可溶性血管内皮细胞生长因子受体1(sFlt-1)与溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)在抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性肾炎患者血清中的表达水平及其相关性。方法选择2016年10月至2017年10月间90例ANCA相关性肾炎患者作为研究组,根据24h尿蛋白水平分为低蛋白尿组和高蛋白尿组。选择同期单纯慢性肾小球肾炎患者共90例作为对照组以及50例健康者作为健康组。分别比较不同组间的血清和尿液中的sFlt-1和LAMP-2水平,并分别研究sFlt-1和LAMP-2水平与ANCA相关性肾炎以及24h尿蛋白的相关性。结果研究组血清和尿液中的sFlt-1和LAMP-2水平均显著高于对照组和健康组(P<0.05)。将尿液和血清中的sFlt-1和LAMP-2纳入Logistic多元回归分析,结果显示血清LAMP-2以及尿液LAMP-2是ANCA相关性肾炎的高危因素(P<0.05)。在ANCA相关性肾炎患者(研究组)中,高蛋白尿组患者血清和尿液中的sFlt-1和LAMP-2水平均显著高于低蛋白尿组(P<0.05),并且均显著高于健康组(P<0.05)。血清和尿液中sFlt-1和LAMP-2与ANCA相关性肾炎患者24h尿蛋白呈现显著的正相关性(P<0.05)。结论慢性肾小球肾炎患者血清和尿液中sFlt-1和LAMP-2水平显著升高,ANCA相关性肾炎患者LAMP-2水平显著高于慢性肾小球肾炎患者,并且血清和尿液中LAMP-2是ANCA相关性肾炎的高危因素。

sFlt-1基因片段对缺氧、高糖下人脐静脉血管内皮细胞及ERK1/2信号通路的影响

目的比较可溶性血管内皮生成因子受体1(sFlt-1)胞外第2～3区和第2～4区对缺氧、高糖条件下血管内皮细胞增生、迁移及细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK 1/2)信号转导通路的影响。方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人胎盘组织cDNA文库中扩增出sFlt-1胞外第2～3区和第2～4区,连接入pcDNA3.1载体后电泳,并进行测序鉴定;以羧甲基化葡聚糖(CMD)纳米磁颗粒为基因载体分别携带2种重组质粒,转染人脐静脉内皮细胞(UVECs)后分别进行正常、缺氧和高糖条件下的培养。MTT法检测各组人UVECs的增生;光学显微镜下观察人UVECs的迁移;Western blot法检测各组人UVECs ERK1/2信号通路下游特异性磷酸化激酶ERK 1/2(p-ERK 1/2)蛋白的表达。结果经过pcDNA3.1/sFlt-1(2-3)或pcDNA3.1/sFlt-1(2-4)转染的人UVECs在缺氧和高糖条件下的增生、迁移及p-ERK 1/2蛋白的表达较转染前均明显下降(P<0.01);2种重组质粒对缺氧和高糖条件下人UVECs增生、迁移及ERK 1/2信号转导通路的影响差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和第2～4区均可抑制缺氧和高糖条件下人UVECs的增生、迁移及ERK1/2信号通路的转导,且2种受体基因片段的作用无明显差异。

PLGF和sTie-2与冠状动脉临界病变患者靶血管定量造影特征的相关性研究

目的分析胎盘生长因子(PLGF)和可溶酪氨酸激酶受体-2(sTie-2)与冠状动脉(冠脉)临界病变患者靶血管定量造影特征的相关性。方法回顾性分析2016年1月～2018年1月于陕西省第四人民医院心血管内科经冠脉造影证实具有冠脉临界病变的183例患者的临床资料。根据不同的冠脉斑块形态进行分组,其中冠脉粥样硬化(AS)组57例、不稳定型心绞痛(UAP)组71例、稳定型心绞痛(SAP)组55例。分析冠脉造影检查结果,检测血浆PLGF和sTie-2水平;比较三组患者血浆PLGF和sTie-2水平、靶血管定量造影特征、病变范围、形态及易损病变;采用Pearson相关性分析PLGF和sTie-2与靶血管定量造影特征的相关性。结果 UAP组血浆PLGF水平显著高于SAP组和AS组(P<0.05),SAP组与AS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);UAP组血浆sTie-2水平显著高于AS组(P<0.05),UAP组与SAP组、SAP组与AS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);SAP组靶血管的最小管腔直径、直径狭窄率、最小管腔面积、面积狭窄率与UAP组、AS组比较,差异有统计学意义(P<0.05),UAP组与AS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);UAP组斑块面积显著大于AS组(P<0.05),UAP组与SAP组、SAP组与AS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);三组患者靶血管的局部病变、偏心病变、光滑病变和易损病变构成比比较,差异有统计学意义(P<0.05);PLGF和sTie-2与靶血管定量造影特征的Pearson相关性分析显示,PLGF与最小管腔面积呈正相关(P<0.05),sTie-2与最小管腔面积、最小管腔直径均呈正相关(P<0.05)。结论冠脉临界病变患者血浆PLGF和sTie-2水平升高,参与斑块内血管新生,与靶血管定量造影特征密切相关,有望成为预测斑块易损性的指标。

血清可溶性血管内皮生长因子受体-1水平有助于预测糖尿病合并脓毒症休克患者预后

目的:探讨血清可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)水平预测糖尿病合并脓毒症休克患者预后的临床价值。方法:收集112例糖尿病合并脓毒症休克患者临床资料,根据患者预后分为死亡组48例和存活组64例。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者入院时血清sFlt-1水平,并检测血糖化血红蛋白和血糖水平,统计比较2组呼吸机和抗生素治疗时长、C-反应蛋白(CRP)水平、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和血清B型尿钠肽(BNP)水平,比较2组患者急性生理与慢性健康状况系统评估(APACHEⅡ)评分。采用单因素和多因素Logistic回归分析影响患者预后的独立危险因素,并采用Pearson相关性分析患者入院后血清sFlt-1水平与入院时CRP水平之间的相关性。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清sFlt-1水平对糖尿病合并脓毒症休克患者预后的预测价值。结果:死亡组患者血清sFlt-1水平、年龄≥60岁、糖化血红蛋白水平、真菌感染和肺部感染占比、两个以上脏器衰竭比例、呼吸机使用时长以及CRP、BNP、PT水平显著高于存活组(P均<0.05),死亡组和存活组感染发生地点比较,差异有统计学意义(P<0.05)。以生存情况(存活=0,死亡=1)为因变量,Logistic回归分析显示年龄(OR=1.950,95%CI:1.138~3.343)、肺部感染(OR=1.844,95%CI:1.053~3.230)、糖化血红蛋白(OR=2.358,95%CI:1.368~4.067)、血清sFlt-1水平(OR=2.519,95%CI:1.119~5.671)、CRP(OR=2.259,95%CI:1.250~4.083)、使用呼吸机时长(OR=2.782,95%CI:1.138~6.799)是影响患者预后的独立危险因素(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示入院后第1天的血清sFlt-1水平与入院时CRP呈明显正相关(r=0.647,P<0.05)。ROC曲线分析显示sFlt-1截断值为465.48 ng/L时,诊断曲线下面积为0.836(95%CI:0.829~0.906),灵敏度为81.25%,特异性为78.13%,约登指数为0.594。结论:糖尿病合并脓毒症休克患者血清sFlt-1水平明显升高,血清sFlt-1水平是影响糖尿病合并脓毒症休克患者预后的独立危险因素。

弥漫大B细胞淋巴瘤并乙型肝炎病毒感染血清sIL-2r、Flt3L、cTfh水平及与预后的关系

目的探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)并乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2r)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、循环辅助T细胞(cTfh)水平及与预后的关系.方法选取2019年3月-2022年3月在新乡医学院第一附属医院收治的60例DLBCL并HBV感染患者为合并HBV组,选取同期收治的60例DLBCL未合并HBV感染患者为未合并HBV组,均在治疗前检测血清sIL-2r、Flt3L、cTfh水平.另选取30名健康志愿者为健康对照组.比较各组间指标水平差异.比较两组患者1年生存差异.利用受试者工作特征(ROC)曲线和多因素COX分析各指标与DLBCL并HBV感染患者预后关系.结果DLBCL患者血清sIL-2r、Flt3L、cTfh水平均高于健康对照组(P<0.05);合并HBV组血清sIL-2r、cTfh、Flt3L水平均高于未合并HBV组(P<0.05).合并HBV组无进展生存率、总生存率均低于未合并HBV组(P<0.05).ROC分析结果显示,sIL-2r、Flt3L、cTfh均具有预测DLBCL并HBV患者的预后价值(P<0.05).多因素COX分析结果显示,淋巴瘤分期(AnnArbor)、非霍奇金淋巴瘤预后(IPI)评分、sIL-2r、Flt3L、cTfh是影响患者预后的危险因素(P<0.05).结论HBV感染可影响DLBCL患者预后,DLBCL并HBV感染患者血清sIL-2r、Flt3L、cTfh高表达,具有预测预后的价值,且Flt3L是影响预后的危险因素.

血塞通注射液对OGD/R损伤小鼠脑微血管内皮细胞VEGF通路表达的影响及机制研究

目的研究血塞通注射液对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤小鼠脑微血管内皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、VEGFR-2和可溶性Fms样酪氨酸激酶1(sFlt-1)蛋白表达的影响,探究其对VEGF通路表达的影响及其可能的作用机制。方法采用OGD/R方法建立细胞缺血再灌注损伤模型,以CCK-8法检测细胞活力,确定实验最适细胞种板浓度、复氧时间和血塞通注射液浓度。实验分为正常组、造模组和实验组,正常组正常培养,造模组只造模不用药培养,实验组造模后给血塞通注射液培养。以Western blot方法检测三组细胞中VEGF、VEGFR-2和sFlt-1蛋白的表达情况。结果细胞氧糖剥夺6 h后,实验最适细胞种板浓度为2.5×104个/ml、复氧时间为6 h、血塞通注射液浓度为100 mg/L。在该条件下,与正常组比较,造模组和实验组VEGF、VEGFR-2和sFlt-1蛋白的表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与造模组比较,实验组中VEGF和VEGFR-2蛋白的表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),sFlt-1蛋白的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血塞通注射液可上调OGD/R损伤的小鼠脑微血管内皮细胞中VEGF通路信号的表达,其上调VEGF通路信号表达的机制可能与sFlt-1蛋白的表达受到抑制有关。

重度急性胰腺炎患者血清生长素-2和s Flt-1之间的关系及临床意义

目的:检测血清生长素-2(Ang-2)、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)在重度急性胰腺炎(SAP)患者中表达情况并探讨其临床意义。方法:选取本院确诊治疗的109例急性胰腺炎(AP)患者为研究对象,同期健康体检者56例作为对照组。酶联免疫吸附(ELISA)法检测各受试者静脉血血清中Ang-2及sFlt-1蛋白水平,ROC曲线分析二者在SAP诊断中的预测价值。结果:与对照组比较,AP患者血清Ang-2、sFlt-1蛋白水平明显增高(P<0.05)。血清Ang-2、sFlt-1水平诊断AP的ROC曲线下面积(AUC)分别为:0.735、0.681。血清Ang-2水平与AP患者CT分级、APACHEⅡ评分及并发急性肺损伤比例有关(P<0.05);血清sFlt-1水平与AP患者CT分级、APACHEⅡ评分、胸水积液及并发急性肺损伤比例有关(P<0.05)。与MAP组比较,SAP组胰腺炎患者血清Ang-2、sFlt-1蛋白水平显著增高(P<0.05)。血清Ang-2、sFlt-1对SAP患者诊断的AUC分别为0.783、0.751。SAP患者血清Ang-2与sFlt-1表达呈正相关(r=0.611,P<0.05)。结论:SAP患者血清Ang-2、sFlt-1显著升高,检测AP患者血清Ang-2、sFlt-1水平对SAP疾病诊断有一定应用价值。