猪CD163游离受体的体内表达与抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染效果的研究

为了验证构建的重组腺病毒rAd-SRCR59-Fc能否在猪体内有效表达游离受体及其能否抑制PRRSV感染,将重组腺病毒注射断奶仔猪,用夹心ELISA检测SRCR59-Fc表达情况;选择PRRSV易感仔猪肌肉注射重组腺病毒rAd-SRCR59-Fc(4×109 TCID50/头),5 d后与JXA1株PRRSV人工感染猪同居饲养,定期测定体温、观察临床症状,采集血样和粪样进行PRRSV定量检测,对病死猪进行病理剖检和主要器官病毒载量测定。结果显示,重组腺病毒接种猪能表达SRCR59-Fc游离受体蛋白,并持续15 d左右;与感染对照组相比,rAd-SRCR59-Fc注射组首次高热时间和临床症状均推迟3 d,第5天~第13天临床症状评分显著低于感染组(P<0.01),至试验结束(25 d)仅有1头猪死亡;肺脏无明显肉眼病变,仅见少量坏死灶,病理切片显示肺泡壁轻微增厚;第3天~第13天病毒血症水平显著低于感染组(P<0.01),第5~第13天粪排毒量低于感染组(P<0.05),器官病毒载量均显著低于感染组(P<0.01)。研究表明CD163游离受体的重组腺病毒能有效阻断PRRSV毒株感染,可以作为PRRS预防或治疗性疫苗进一步研究。

猪圆环病毒2型Cap蛋白及传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的VLPs自组装表达与免疫效力评价

为了利用同一重组大肠杆菌实现不同种动物疫病来源类病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)的高效组装表达,试验将编码猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白的核苷酸序列分别克隆至pET28a-Rcodon载体中,并分别转化至改造的BL21(DE3)△lpxM tig+感受态细胞中,利用纳米粒度电位仪及透射电子显微镜分析目的蛋白表达后的胞内组装情况,并用纯化后的抗原蛋白制备的疫苗免疫动物进行免疫效力评价。结果表明:PCV2 Cap蛋白和IBDV VP2蛋白的可溶性表达水平较优化前对照组均分别提高90%左右,且目的蛋白在胞内高效自组装形成了VLPs,并排列呈均一的晶格结构;含VP2抗原的亚单位疫苗可提供100%的保护效果,含PCV2抗原的亚单位疫苗的抗体水平较高,显著高于阴性对照组纯化后的抗原蛋白制备的疫苗(P<0.05)。说明PCV2 Cap蛋白和IBDV VP2蛋白在BL21(DE3)△lpxM tig+感受态细胞中均可实现高效可溶性表达与细胞内VLPs自组装,且免疫原性良好,能够给免疫动物提供较好的免疫保护。

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×10^(8)IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2^(-10.29),抗PEDV活性为2.72 IU,表明srPoIFN-α具有良好抗PEDV活性。这些结果为进一步开发可溶性IFNα药物制剂提供参考。