基于TLR4-NF-κB信号通路的槐果碱改善人支气管上皮细胞炎症和黏液高分泌的机制

目的基于TLR4-NF-κB信号通路探讨槐果碱(SC)体外抗炎作用及其抗哮喘的潜在效应机制。方法采用脂多糖(LPS)刺激人支气管上皮细胞NCI-H292诱导体外炎症模型,给予不同浓度SC进行治疗。采用MTT法筛选LPS和SC对NCI-H292细胞的安全浓度;设Control组、LPS组(10μg/mL LPS)、SC组(10μg/mL LPS+不同浓度SC),ELISA法检测细胞中黏蛋白5AC(MUC5AC)的表达和上清液中白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的分泌情况;RT-PCR法检测细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8、髓样分化因子(MyD88)和核因子-κB(NF-κB p65)mRNA的表达;Western blot方法检测细胞中Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)、磷酸化p38(p-p38)和磷酸化p65(p-p65)以及细胞核内NF-κB p65的蛋白表达。结果MTT结果显示,LPS和SC分别在0~10μg/mL、0~40μg/mL浓度范围内对细胞活力无影响;ELISA结果表明,与Control组相比,LPS组细胞中MUC5AC含量极显著升高(P<0.01),细胞上清液中IL-6、IL-8也极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,SC组细胞中MUC5AC含量极显著降低(P<0.01),细胞上清液中IL-6、IL-8也极显著降低(P<0.01);RT-PCR结果显示,与Control组相比,LPS组细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8、MyD88和NF-κB p65 mRNA表达均极显著升高(P<0.01),而SC组细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8 mRNA的表达显著降低(P<0.05),MyD88和NF-κB p65 mRNA的表达极显著降低(P<0.01)。Western blotting结果表明,SC可极显著降低LPS诱导的NCI-H292细胞中TRAF6、TLR4、p-p38和p-p65以及细胞核内NF-κB p65蛋白表达(P<0.01)。结论SC可能通过抑制TLR4-NF-κB信号通路,改善气道炎症和黏液高分泌,进而发挥抗哮喘的作用。

槐果碱抑制糖尿病大鼠肾损伤、NLRP3炎性小体和NF-κB通路活化

目的 观察槐果碱(sophocarpine, SC)对糖尿病大鼠肾损伤的影响,并探讨其相关机制。方法 选用SD大鼠,以高脂饮食12周和链脲佐菌素处理制作糖尿病模型,灌胃给予槐果碱治疗12周。PAS染色以及纤连蛋白(fibronectin, FN)和Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色评估肾组织损伤,ELISA检测肾组织中IL-1β及IL-6水平,Western blot检测肾组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)、Cleaved Caspase-1和NF-κB p65蛋白表达水平。结果 糖尿病大鼠肾重指数、尿蛋白排泄水平、血清尿酸水平、肾小球系膜基质扩张系数均较对照大鼠明显升高,肾组织中FN、Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-6、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1和NF-κB p65蛋白水平均较对照大鼠明显上调,槐果碱干预能明显抑制糖尿病大鼠上述指标变化。结论 槐果碱可能通过抑制NLRP3炎性小体和NF-κB通路活化来减轻糖尿病大鼠的肾损伤。

槐果碱对人肠癌细胞HCT-116生长抑制作用

目的探讨槐果碱对人肠癌细胞HCT-116生长的影响。方法选取人肠癌细胞HCT-116,用不同浓度梯度槐果碱作用48 h后,通过细胞毒性试验检测增殖能力,根据IC_(50)选择3个浓度进一步实验。通过平板克隆形成实验检测细胞克隆能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,线粒体膜电位检测线粒体膜电位水平,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白及生存素(survivin)的表达水平。结果细胞毒性试验显示,槐果碱可抑制HCT-116肿瘤细胞增殖,且随着槐果碱浓度的升高抑制作用增强。IC_(50)为2.134 mmol/L,并选择1、2和4 mmol/L进行进一步相关实验;在槐果碱作用后HCT-116细胞克隆能力、线粒体膜电位水平均明显下降,细胞凋亡率明显升高(P<0.05);槐果碱作用后,HCT-116细胞内Bcl-xL、Bcl-2、survivin表达显著下调,而Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9显著上调。结论槐果碱可抑制肠癌细胞HCT-116增殖并通过线粒体途径促进凋亡。

氧化槐果碱对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制

目的探究氧化槐果碱(oxysophocarpine,OSC)对大鼠MIRI的保护作用及其作用机制。方法超声心动图仪检测心脏功能指标;HE染色观察心肌组织病变;ELISA法检测心损标记物及血清炎症因子水平;试剂盒检测氧化应激标记物;蛋白质印迹检测相关蛋白表达水平。结果与sham组相比,I/R组大鼠出现明显心肌损伤,心脏功能明显降低,CK-Mb、Mb和cTnI水平显著上调;血清SOD水平明显降低,MDA和LDH水平升高;TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平均明显升高,p-ERK1/2和p-JNK表达显著上调。与I/R组相比,OSC处理后明显改善心肌损伤和心肌功能;抑制心肌氧化应激和促炎性因子释放;下调p-ERK1/2和p-JNK表达。结论OSC可改善大鼠I/R导致的心脏功能障碍,并抑制氧化应激和炎症反应,其作用机制与ERK/JNK通路下调有关。

LC-MS法测定槐果碱及其在Caco-2细胞上的转运特征

目的：建立槐果碱的LC—MS测定法，研究其在Caeo-2细胞上的转运特征。方法：采用Zorbax Extend-C18柱，流动相10mmol·L^-1醋酸铵水溶液-乙腈（85：15），流速0．2mL·min^-1。电喷雾离子化（ESI）方式，采用选择性离子检测法，检测离子为正离子，槐果碱的选择性离子为[m／z＋H]^＋247．3；考察了温度、药物浓度、时间对槐果碱在Caco-2细胞上转运的影响。结果：槐果碱在5—2000μg·L^-1呈良好的线性关系（r=0．9985），最低定量限为5μg·L^-1；槐果碱在Millicell系统上的转运量具有一定的浓度-时间依赖性，其转运表现为被动扩散，槐果碱的平均表观通透系数Papp为3．159×10^-5cm·s^-1。结论：该法灵敏、简单，专属性强，槐果碱在Caeo-2细胞上具有良好的转运。

槐果碱对SNI致神经病理性疼痛小鼠脊髓组织TLR4/p38 MAPK的影响

目的观察槐果碱(sohpocarpine,SC)对坐骨神经分支保留性损伤(spared nerve injury,SNI)致小鼠神经病理性疼痛的缓解作用,并探讨其部分作用机制。方法将60只♂ICR小鼠随机分为6组,分别为:假手术组(control)、神经病理性疼痛模型组(model)、普瑞巴林阳性对照组(SNI+普瑞巴林10 mg·kg^(-1))、槐果碱高、中、低剂量组(SNI+sophocarpine 40、20、10 mg·kg^(-1))。采用SNI法建立小鼠神经病理性疼痛动物模型,于术前1 d、术后d 7(给药前d 1)及给药后1、3、5、7 d测定小鼠机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)、热刺激缩足反应潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)及冷缩足反射次数(cold withdrawal times,CWT);采用RT-PCR和Western blot法检测槐果碱对SNI损伤小鼠脊髓组织TLR4、p38 MAPK、IL^(-1)β、TNF-αm RNA及蛋白表达的影响。结果与假手术组比较,SNI致神经病理性疼痛模型组小鼠术后PWMT明显降低、PWTL明显缩短、CWT明显增多;小鼠脊髓组织p38 MAPK、TLR4、TNF-α、IL^(-1)βm RNA和蛋白表达水平明显上调。与模型组小鼠比较,SNI+槐果碱40 mg·kg^(-1)组小鼠给药后PWMT明显升高、PWTL延长、CWT减少;小鼠脊髓组织p38MAPK、TLR4、TNF-α、IL^(-1)βm RNA和蛋白表达水平明显下调。结论槐果碱对SNI致神经病理性疼痛有较好的缓解作用,其机制可能与其下调TLR4、p38 MAPK、IL^(-1)β及TNF-α表达水平有关。

HPLC-MS法同时测定大鼠血浆中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱的浓度及其药代动力学

建立同时测定大鼠灌胃给予三物黄芩汤后血浆中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱含量的HPLC-MS分析方法,并计算了3种生物碱在大鼠体内的药代动力学参数。血浆样品经氯仿液-液萃取后,以乙腈-0.1%甲酸水溶液(10∶90)为流动相,用KromasilC18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)分离,采用电喷雾离子化源(ESI)单重四极杆串联质谱,以选择离子检测(SIM)方式进行检测。苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱分别在10～5000ng.mL-1、2～1000ng.mL-1和2～1000ng.mL-1呈良好线性关系,提取回收率分别为89.1%～93.5%、83.9%～91.3%、85.4%～88.0%。日内及日间精密度均<15%。该法快速,灵敏,专属,适用于同时测定生物样本中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱的血药浓度。

HPLC法同时测定苦豆子总碱中槐定碱、苦参碱和槐果碱的含量

目的:建立同时测定苦豆子总碱中槐定碱、苦参碱及槐果碱含量的 HPLC 测定法。方法:色谱柱为 Hypersil-NH_2柱(4.6mm×200mm,5μm),流动相为乙腈-磷酸缓冲液(1.0mL 磷酸加入到1000mL 水中,三乙胺调 pH 2.5)-无水乙醇(80:10:10),检测波长为220nm,柱温35℃,流速1.0mL·min^(-1),进样量20μL。结果:槐定碱、苦参碱、槐果碱分别在13.0～108.0mg·L^(-1)、11.4～95.2mg·L^(-1)和4.6～82.1mg·L^(-1)浓度范围内呈良好的线性关系,r 分别为0.9999,0.9996,0.9999。平均回收率(n=9)分别为99.41%,100.0%,100.6%。结论:可通过 HPLC 法同时测定苦豆子总碱中槐定碱、苦参碱和槐果碱的含量,并可用该方法进行苦豆子药材及含苦豆子的成药的质量控制。

氧化槐果碱的提取分离工艺及其毒性研究

采用80％的酸性乙醇提取、硅胶柱层析分离、乙醚分级沉淀、丙酮重结晶的工艺方法，从苦参中分离得到氧化槐果碱单体。以小鼠为试鼠进行毒性测定，结果表明，试鼠的死亡时间主要集中在48h内，48h后无试鼠的死亡现象。试鼠对氧化槐果碱的耐受量为25-150mg·kg^-1，致死中量LD50为81．00mg·kg^-1，LD50标准误差3．68。氧化槐果碱毒性较低，致死中量适宜，可以作为杀鼠剂使用。

RP-HPLC法同时测定复方苦参注射液中氧化槐果碱、氧化苦参碱和苦参碱的含量

目的建立复方苦参注射液中氧化槐果碱、氧化苦参碱和苦参碱的含量测定方法。方法Hypersil ODS2色谱柱（200mm×4．6mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-水-磷酸（体积比为10．00：30．00：65．00：0．05．含33mmo·L^-1的SDS）。检测波长为210nm，柱温为室温。结果氧化槐果碱质量浓度在2．52～50．4mg·L^-1内与峰面积呈良好线性关系，r=0．9999（n=6），平均回收率为98．2％。RSD为1．8％（n=9）；氧化苦参碱质量浓度在17．44-174．4mg·L^-1内与峰面积呈良好线性关系。r=0．9997（n=6），平均回收率为99．5％，RSD为2．2％（n=9）；苦参碱质量浓度在1．96～39．20mg·L^-1内与峰面积呈良好线性关系，r=0．9997（n=6），平均回收率为102．3％，RSD为2．0％（n=9）。结论测定方法可作为复方苦参注射液质量控制方法。

槐果碱的镇痛抗炎作用研究

目的对槐果碱的镇痛抗炎作用进行研究。方法通过热板法和扭体法观察槐果碱的镇痛作用;采用二甲苯诱导小鼠耳肿胀法和角叉菜胶致大鼠足肿胀法观察槐果碱的抗炎作用。结果槐果碱能提高小鼠对热刺激的痛阈值,抑制醋酸所致的小鼠疼痛,表明其有镇痛作用;槐果碱能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶所致的大鼠足跖肿胀,表明其有抗炎作用。结论槐果碱具有一定的中枢和外周镇痛作用,同时具有抗急性炎症作用。

槐果碱对HERG钾通道电生理功能的影响

HERG(human ether-a-go-go-related gene)钾通道在心律失常的发生及治疗中具有重要作用,因此已成为近些年来的研究热点。本研究应用全细胞膜片钳技术记录在HEK(human embryonic kidney)293细胞上稳定表达的HERG钾通道的电流和动力学曲线(激活、失活、复活和去活化)来研究不同浓度槐果碱对HERG电流及动力学曲线的影响,以了解槐果碱抗心律失常的作用机制。结果表明,槐果碱浓度依赖性地抑制HERG时间依赖性电流(Istep)及其尾电流(Itail)。在0 mV时,10、30、100及300μmol.L-1槐果碱对Istep的抑制率分别为(10.7±2.8)%、(11.3±5.5)%、(47.0±2.3)%及(53.7±2.5)%,对Itail的抑制率分别为(1.1±3.0)%、(17.1±3.3)%、(32.7±1.9)%(P<0.05,n=12)及(56.0±2.4)%(P<0.05,n=13)。100μmol.L-1槐果碱作用后失活时间常数减小,失活速率变快;复活时间常数在大部分指令电压下明显减小(P<0.01,n=12),复活速度加快;瞬时失活时间常数减小(P<0.05,n=12);稳态激活、去活化无明显改变。由此可看出,槐果碱通过影响通道的失活过程抑制HERG钾电流,使得心肌细胞复极时间延长,改善快速性心律失常。

槐果碱体外抗柯萨奇病毒B3m的作用

目的 以HeLa细胞为模型，观察从苦参中提取的槐果碱在体外抗柯萨奇病毒B3m（CVB3m）的作用。方法 ①用微量细胞培养法观察槐果碱对HeLa细胞的毒性。②用细胞病变效应（CPE）抑制法观察槐果碱体外抗CVB3m作用。③用MTT法和结晶紫染色法观察槐果碱对CVB3m感染的HeLa细胞的保护作用：在96孔板上种植HeLa细胞并予CVB3m吸附1h，加入不同浓度的槐果碱，并设立病毒、细胞、槐果碱对照，培养15h后以MTT法和结晶紫染色法测定比较各组细胞能量代谢率和细胞存活数。结果 ①槐果碱稀释到〈391μg／mL，对HeLa细胞无毒性；≥783μg／mL引起HeLa细胞CPE。②槐果碱6．25～50μs／mL有直接抗病毒作用，减轻CPE；〉100μg／mL反而会加重、加快CPE。③槐果碱1．56～25μg／mL对感染CVB3m的HeLa细胞有保护作用，用MTT法和结晶紫染色法测得细胞能量合成代谢、细胞存活数较病毒对照组增加（P〈0．05）；槐果碱在50、100μg／mL时反而加重病毒对细胞的抑制，使细胞存活数、细胞代谢率较病毒对照组下降（P〈0．05）。结论 一定浓度的槐果碱在体外有抗CVB3m作用，对感染CVB3m的HeLa细胞有保护作用。

反相高效液相色谱同时测定苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和槐胺碱的含量

目的 :建立同时测定苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和槐胺碱的 HPL C方法。方法 :用 VP-ODS150 mm× 4.6mm,5μm色谱柱 ,柱温 50℃ ,以甲醇 -水 -三乙胺 (55∶ 45∶ 0 .2 )为流动相 ,紫外检测波长 2 15nm,流速 0 .8ml/ min。结果 :在所确立的色谱条件下 4种生物碱得到很好地分离 ,标准曲线显示在 0 .1～ 0 .7μg范围内具有良好的线性关系 ,平均回收率为98.5%～ 10 1.0 %。结论 :该方法简便、快速、准确 ,可用于生药及制剂中苦参碱、氧化苦参碱。

液-质联用研究槐定碱、槐果碱和苦参碱在兔体内的药代动力学

建立了一种液-质联用测定家兔血浆中槐定碱、槐果碱和苦参碱浓度的方法，并用于生物碱的药代动力学研究。分析方法的线性范围为槐定碱13．2-995．0μg/L，槐果碱7．0～530．0μg/L和苦参碱8．8～655．0μg/L，回收率为90．2％～99．8％。药代动力学参数计算结果表明，槐定碱和槐果碱符合二室模型，而苦参碱则符合三室模型。比较苦黄注射液和混合标准品注射后的药代动力学参数，表明苦黄注射液中的其他成分对槐果碱有促进其消除的作用，对槐定碱的消除可能有促进作用，而对苦参碱则没有影响。

槐果碱体外对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg HBeAg的影响

目的:探讨槐果碱的体外抗乙型肝炎病毒作用。方法:采用HepG2.2.15细胞模型进行体外培养,给予不同浓度槐果碱,以拉米夫定作阳性对照,作用9天后检测上清液中HBsAg、HBeAg的分泌,观察药物对HepG2.2.15细胞分泌HBV病毒抗原的影响,同时以MTT法检测药物在体外对HepG2.2.15细胞的生长抑制作用,从而评价药物的抗HBV作用。结果:药物作用9天后,槐果碱对HepG2.2.15细胞的50%生长抑制率(TC50)为0.002M,对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的50%抑制率(IC50)为4.9uM,其治疗指数(TI=TC50/IC50)为408.16;而拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率在所选浓度范围内均低于50%。槐果碱对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率在所选浓度范围内均低于50%,但明显优于拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率。结论:槐果碱在体外具有显著的抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,是一个高效低毒的抗乙肝病毒的有效药物。

血浆中氧化槐果碱的气相色谱测定及其在兔体内的药代动力学

氧化槐果碱(oxysophocarpine)是从苦参(Sophora flavesecens Ait)中分离得到的一种生物碱。已报道的含量测定方法有薄层层析比色法和高效液相层析法。近年来临床发现苦参总碱有平喘、升高白细胞。

槐果碱的心脏电生理效应

目的研究中药单体槐果碱对心脏快、慢反应动作电位和离体心脏心电图的影响,初步探讨其抗心律失常的机制。方法应用细胞内微电极技术和Langendorff离体心脏灌流的方法,研究槐果碱对心肌细胞快、慢反应动作电位和离体心脏心电图的影响。结果槐果碱可使豚鼠心室乳头肌快反应动作电位的时程(APD50,APD90)和有效不应期(ERP)延长,0期上升速率(Vmax)降低,且呈剂量依赖性变化;可使家兔窦房结慢反应动作电位4期自动除极速率(SDVP4)、自律性兴奋频率(SEF)和动作电位幅值(APA)明显减小,此效应亦呈浓度依赖性;在豚鼠离体心电图实验中,槐果碱能对抗肾上腺素诱发的快速性心律失常。结论根据槐果碱对动物心脏电生理活动的影响,初步推测其可能通过抑制钠、钾和钙离子通道而产生抗心律失常效应。

不同提取方法对苦豆子中氧化槐果碱与槐果碱含量的影响

目的研究不同提取方法对氧化槐果碱与槐果碱含量变化的影响。方法采用HPLC法测定不同产地、不同提取条件的苦豆子样品中氧化槐果碱和槐果碱的含量。结果饱和氢氧化钠溶液能使氧化槐果碱转化,对槐果碱无影响。结论为苦豆子及制剂的质量控制以及氧化槐果碱的综合利用提供依据。

槐果碱、氧化槐果碱的药代动力学与药效动力学

以QTc延长率为效应指标,用药代动力学-药效动力学结合模型对槐果碱、氧化槐果碱ⅳ后在兔体内的处置和效应动力学作定量分析。两药的血浓时程均符合二房室模型,两药的效应与效应室浓度之间的关系均符合S形Emax模型。两药彼此的药动学和药效学性质均有明显差异,但它们各自的药动学和药效学性质均为非剂量依赖性。