新型聚羟基脂肪酸酯合成菌Massilia sp.UMI-21的碳源优化及其产物表征

随着石油工业的发展,传统石油基塑料在人类的生产和生活中越来越不可或缺。然而这些石油基塑料在废弃过程中产生的有毒气体对人类、动物以及环境造成的伤害也日趋严重,因此具有与石油基塑料类似性质的可替代材料的开发势在必行。其中微生物合成的一类天然聚羟基脂肪酸酯(PHAs)因为具有和石油基塑料类似的性质而广受关注。本研究以从绿藻Ulva中分离出的一种具有PHA生产能力的微生物Massilia sp.UMI-21为研究目标,以12种多糖作为碳源评估该菌株生产PHA的潜力。碳源优化结果表明该菌株可利用淀粉和木聚糖蓄积PHA。在优化的培养条件下,使用淀粉作为碳源扩大Massiliasp.UMI-21培养规模后,从菌体中提取的物质为含有3HB结构的单聚酯P(3HB)。

来源于马赛菌(Massilia sp.)UMI-21的ACS_(MU)和PhaC_(MU)体外表达及功能研究

【目的】构建马赛菌(Massilia sp.)UMI-21来源乙酰辅酶A合成酶ACS_(MU)和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)合酶PhaC_(MU)的体外重组表达体系并过表达2种酶,利用体外合成体系确定2种酶在Massilia sp.UMI21聚3-羟基丁酸(polyhydroxybutyrate,PHB)合成途径中的主要功能。【方法】利用无缝克隆技术将来源于Massilia sp.UMI-21的乙酰辅酶A合成酶基因acsMU和PHA合酶基因phaC_(MU)扩增后与pQE-80L质粒连接,转导大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)构建2个基因的重组表达体系;利用6×His标签纯化蛋白ACS_(MU)和PhaC_(MU),并采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]法测定其活性;使用体外单相合成系统(one-phase reaction system,OPRS),以(R)-3HB为底物,验证ACS_(MU)和PhaC_(MU)这2种酶在合成PHB途径中的功能。【结果】成功构建了ACS_(MU)和PhaC_(MU)蛋白重组表达菌株BL21-pQE-80L-acsMU和BL21-pQE-80L-phaC_(MU),提纯得到过表达蛋白ACS_(MU)和PhaC_(MU)产率分别为24.8 mg/L和25.6 mg/L;ACS_(MU)酶比活力为(0.148±0.011)U/mg。PhaC_(MU)酶对(R)-3HBCoA的比活力为(0.102±0.011)U/mg;核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy,^(1)H-NMR)分析结果表明,使用ACSPt-PCT_(CP)-PhaC_(Re)、ACS_(MU)-PCT_(CP)-PhaC_(Re)和ACS_(MU)-PCT_(CP)-PhaC_(MU)这3条OPRS途径均能合成PHB,产量分别为0.62、0.76和0.64 g/L。【结论】acsMU和phaC_(MU)基因可利用大肠杆菌表达体系过表达并可获得具有活性的可溶性蛋白;对比ACSPt-PCT_(CP)-PhaC_(Re)合成体系,ACS_(MU)替代ACSPt合成PHB产量增加22.58%,在聚合酶相同的情况下,PHB的合成产量依赖乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)合成乙酰辅酶A的稳定性。使用PhaC_(MU)代替PhaC_(Re),对比ACS_(MU)-PCT_(CP)-PhaC_(Re)组合,合成PHB产量减少了15.79%。在聚合前体浓度相同的情况下,PHB合成量依赖聚合酶的活性。