甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

目的构建甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rSpaO—OmpA免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因，构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO—OmpA表达情况及其产量。采用免疫扩散法、微量肥达和Westernblot法鉴定rSpaO—OmpA抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用，实验中采用重组表达的SpaO（rSpaO）及OmpA（rOmpA）作为对照。结果所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统EcoliBk21DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA。rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号，免疫家兔后可产生特异性抗体。100汕g或2006xgrSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66．7％（8／12）和83．3％（10／12），明显高于等量rSpaO及rOmpA（P〈0．05）。rSpaO—OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1：5～1：40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO—OmpA免疫双扩散效价为1：1～1：16。结论人工融合重组抗原rSpaO—OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强。

鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达

以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因。利用SOE-PCR技术,成功构建OmpA-DuIL-2融合基因,片段大小为1551bp。将其转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61 kDa的融合蛋白,经Western-blot分析该融合基因同时具OmpA和DuIL-2的反应原性。

猪流行性腹泻病毒N-E.coli OmpA融合基因构建、表达及其免疫原性评价

为获得免疫原性更强的猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白,试验将PEDV N蛋白基因和大肠杆菌(E.coli)OmpA蛋白基因进行融合,采用柔性linker联接,得到OmpA-linker-PEDV N融合基因,并克隆至pCold I质粒,构建重组质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N。重组质粒转入BL21感受态细胞,SDS-PAGE分析重组质粒的表达,并对其编码的融合蛋白进行二级和三级结构预测。Western-blot和ELISA分析融合蛋白的免疫原性。结果表明:构建了融合基因表达质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N,表达了约88 ku的融合蛋白;融合蛋白的二级结构未发生明显变化,三级结构预测可折叠为正确的空间构像。该融合蛋白同时具有PEDV N蛋白和OmpA蛋白的免疫原性,并且其免疫原性显著高于单一PEDV N蛋白。说明试验获得了免疫原性较好的融合基因表达蛋白,可以为PEDV N蛋白功能研究、特异性抗体制备以及PEDV亚单位疫苗的研制提供材料和研究基础。