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Spacer区蛋白对ADAMTS13活性影响的研究 被引量:2
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作者 马珍妮 凌婧 +4 位作者 殷杰 沈飞 苏健 谢丽倩 阮长耿 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1596-1601,共6页
目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS13功能发挥的作用。方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,... 目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS13功能发挥的作用。方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,收集超声上清并鉴定。并大规模诱导表达,利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化产品纯度和免疫学活性。利用重组蛋白与免疫性调节的血栓性血小板减少性紫癜(iTTP)患者血浆孵育,检测血浆中ADAMTS13的活性变化。结果:成功构建能表达spacer区的原核表达质粒并能有效表达蛋白。Western blotting结果显示,抗6×His抗体和抗人ADAMTS13抗体(针对Gln34-Trp688)分别能与重组蛋白在15 kDa处显单一条带。功能实验表明,该重组蛋白能够有效逆转iTTP患者中被自身抗体抑制的ADAMTS13酶活性。结论:重组蛋白具有较好的免疫原活性和纯度,为进一步研究spacer区对iTTP的发病机理提供了实验依据。 展开更多
关键词 spacer区域 血管性血友病因子裂解酶 原核表达
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血管性血友病因子裂解酶间隔区结构域突变对酶生物学功能的影响
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作者 王萌 吴昊 +2 位作者 李华 赵艺鸿 金圣宇 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期900-907,共8页
目的:探讨血管性血友病因子裂解酶ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型13(ADAMTS13)间隔区结构域在血管性血友病因子(vWF)裂解过程中的生物学功能,阐明ADAMTS13在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)发病机制中的作用。方法:将ADAMTS13间隔区结构... 目的:探讨血管性血友病因子裂解酶ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型13(ADAMTS13)间隔区结构域在血管性血友病因子(vWF)裂解过程中的生物学功能,阐明ADAMTS13在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)发病机制中的作用。方法:将ADAMTS13间隔区结构域中的氨基酸残基TEDRLPR以点突变技术逐个基因突变(突变体M1~M7),将构建的ADAMTS13与其突变体质粒转染至人胚肾HEK293细胞,稳定表达后提纯重组蛋白。观察野生型和突变型ADAMTS13在变性条件、剪切应力作用和ADAMTS13抗体处理后裂解vWF的能力。结果:荧光共振能量转移(FRET)实验,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)对FRET-vWF73剪切能力降低(P<0.05)。变性条件下,野生型ADAMTS13可以将vWF多聚体裂解,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)的裂解活性明显降低(P<0.01)。在体外剪切应力作用下,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)裂解vWF多聚体的能力明显降低(P<0.01)。与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)与vWF之间的结合力差异无统计学意义(P>0.05),表明ADAMTS13的C末端与vWF之间存在多个结合位点。ADAMTS13抗体处理可在一定程度上抑制野生型和突变型ADAMTS13裂解vWF的能力。结论:间隔区突变后ADAMTS13的活性降低。ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)可能是ADAMTS13在底物识别时的重要作用位点。 展开更多
关键词 血管性血友病因子裂解酶 ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型13 间隔区结构域 血管性血友病因子 血栓性血小板减少性紫癜
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Identification of Stellaria media by PCR 被引量:6
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作者 黄文哲 董婷霞 +2 位作者 戚欢阳 卢振强 詹华强 《Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences》 CAS 2005年第3期144-148,共5页
Aim To provide a rapid and reliable method for identifying the fork medicine Stellaria media (Linn. ) Cyr. (Herba Stellariae mediae) (Caryophyllaceae) from its adulterant Myosoton aquaticure (L.) Fries (Herba... Aim To provide a rapid and reliable method for identifying the fork medicine Stellaria media (Linn. ) Cyr. (Herba Stellariae mediae) (Caryophyllaceae) from its adulterant Myosoton aquaticure (L.) Fries (Herba Myosoti aquatici) (Caryophyllaceae) by polymerase chain reaction (PCR) technology. Methods A molecular genetic approach has been developed to identify S. media for the first time. 5S-rRNA spacer domain was amplified by PCR from the isolated genomic DNA, and the PCR products were then sequenced. Results The nucleotide sequences of S. media and M. aquaticum were measured to determine their identity. Furthermore, the nucleotide sequences of three Stellaria species, S. vestita, S. longifolia and S. radians, were also measured for the sake of providing the evidence of the biological phylogeny of SteUaria. Diversity between DNA sequence and restriction enzyme mapping among a variety of the species was found in their 5S-rRNA spacer domains. Conclusion The 5S-rRNA spacer domains can be used as a molecular marker for differentiating S. media from M. aquaticum and in phylogenetie studies of Stellaria. 展开更多
关键词 Stellaria media Myosoton aquaticum 5S-rRNA spacer domain DNA sequence Stellaria
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我国代表地区须癣毛癣菌复合体的分子鉴定与分型研究 被引量:12
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作者 胡小平 万喆 +1 位作者 王晓红 李若瑜 《中国真菌学杂志》 2011年第2期70-76,共7页
目的对我国代表地区的须癣毛癣菌菌株进行分子再鉴定和分型研究。方法选取我国南北方8个省市地区经表型鉴定的须癣毛癣菌菌株47株,通过再培养形态观察、生理试验;PCR扩增核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)D1-D2区... 目的对我国代表地区的须癣毛癣菌菌株进行分子再鉴定和分型研究。方法选取我国南北方8个省市地区经表型鉴定的须癣毛癣菌菌株47株,通过再培养形态观察、生理试验;PCR扩增核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)D1-D2区,测序后利用数据库进行序列比对,对须癣毛癣菌复合体进行再鉴定;PCR扩增rDNA非转录间隔区(NTS)的三个串联重复亚单位S0、S1和S2区,进行种内分型,并比较不同部位来源菌株型别的差异性。结果我国南北方8个省市地区47株须癣毛癣菌中3株鉴定为断发毛癣菌,6株鉴定为无性型苯海姆节皮菌,其余均鉴定为万博节皮菌中的亲人型趾间毛癣菌;三对不同引物扩增38株趾间型毛癣菌和2株苯海姆节皮菌NTS区,共产生28种特征性带型。带型和菌株来源及发生部位无相关性。结论我国分离自人类须癣毛癣菌复合体的主要组成菌种为趾间毛癣菌;ITS区结合LSU D1-D2区测序有助于鉴定须癣毛癣菌复合体至种水平;NTS区的三个串联重复亚单位所产生的特征性指纹图提供了一种快速、稳定的分子生物学种内分型方法,可应用于趾间毛癣菌感染的流行病学研究。 展开更多
关键词 须癣毛癣菌复合体 rDNA内转录间隔区 核糖体大亚基D1-D2区 rDNA非转录间隔区
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人工锌指核酸酶的电子设计与结构模拟
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作者 张勇 蒋泓 +3 位作者 邓廷贤 粟文俊 杨莉珊 唐冬生 《实验室研究与探索》 CAS 北大核心 2011年第10期14-18,27,共6页
以电子设计用于猪的多位点基因打靶的人工锌指核酸酶为例,探索如何电子设计优化理想的人工锌指核酸酶,以减少人工锌指核酸酶的毒性。采用OPEN电子设计方法,生物信息学方法的预测分析ZFP的立体结构,设计优化合适的连接体和间隔体组合,并... 以电子设计用于猪的多位点基因打靶的人工锌指核酸酶为例,探索如何电子设计优化理想的人工锌指核酸酶,以减少人工锌指核酸酶的毒性。采用OPEN电子设计方法,生物信息学方法的预测分析ZFP的立体结构,设计优化合适的连接体和间隔体组合,并通过突变优化Fok I异源二聚体。采用OPEN法设计三指ZF序列,并连接为ZFP序列,设计出长度为6 bp且富含AT碱基的spacer,加上长度为4个氨基酸残基的inter-domain linker,连接FokⅠ切割结构域双突变子异源二聚体,并通过各种软件工具对ZFN的空间结构进行模拟预测,所设计得到的ZFN的有效率超过50%。探索获得电子设计理想ZFN的方案,即特异性结合DNA的锌指蛋白、最佳的linker和spacer的长度与组合以及优化的特异性切割的Fok I异源二聚体切割结构域。 展开更多
关键词 锌指核酸酶 锌指蛋白 连接体 间隔体 FokI切割域
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乙型肝炎病毒聚合酶蛋白多态性的生物信息学分析及其意义
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作者 陈喆 朱悦 +1 位作者 李亦学 闻玉梅 《微生物与感染》 2006年第2期67-75,80,共10页
目的通过Bio-HBV生物数据库,针对乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶蛋白序列进行多态性分析。方法构建Bio- HBV生物数据库,获得国际基因序列库中所有完整的聚合酶蛋白并进行比对,采用信息熵评价序列位点的保守性,结合BLOSUM 90评分系统和PAML方法... 目的通过Bio-HBV生物数据库,针对乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶蛋白序列进行多态性分析。方法构建Bio- HBV生物数据库,获得国际基因序列库中所有完整的聚合酶蛋白并进行比对,采用信息熵评价序列位点的保守性,结合BLOSUM 90评分系统和PAML方法,寻找选择压力下的理化性质异常的氨基酸替换模式。结果rt266-271内频发理化性质异常的氨基酸替换,并且具有高度的统计学意义。此外,还用生物信息学的方法分析了聚合酶蛋白的TP、RT和RH功能域的保守性。结论用生物信息学验证了功能域内已知生物学特性位点的保守性,还从结构生物学出发,推测潜在的功能位点及其意义。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 聚合酶蛋白 多态性分析 TP域 spacer RT域 RH域
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一种基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的靶向CD19 CAR-T细胞构建及抗白血病的功能研究 被引量:1
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作者 张灿 安志静 +2 位作者 白玥 王琛琛 钟晓松 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第16期1988-1992,共5页
目的:构建一种基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的靶向CD19 CAR-T细胞(CART19),并在体内和体外证明其抗肿瘤的能力。方法:构建CD19 CAR的逆转录病毒载体,逆转录病毒转导植物血球凝集素(PHA)刺激的健康志愿者T细胞,从而获得CART19... 目的:构建一种基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的靶向CD19 CAR-T细胞(CART19),并在体内和体外证明其抗肿瘤的能力。方法:构建CD19 CAR的逆转录病毒载体,逆转录病毒转导植物血球凝集素(PHA)刺激的健康志愿者T细胞,从而获得CART19细胞;采用流式细胞术和Western blot检测转导效率;采用流式细胞术检测细胞内CD107a和IFN-γ水平,以及CFSE染色后的细胞增殖情况;4 h荧光杀伤实验评估CART19细胞的体外抗肿瘤能力;ELISA法检测共培养上清液的IFN-γ释放水平;建立白血病小鼠模型评估CART19细胞的体内抗肿瘤作用。结果:成功构建了一种新的CART19细胞;CD19^(+)细胞可以特异性刺激CART19细胞表达CD107a和IFN-γ、促进CART19细胞增殖以及分泌IFN-γ;4 h共培养荧光杀伤实验显示CART19细胞对NALM6-GL具有良好的体外抗肿瘤活性;CART19细胞可以显著提高白血病小鼠的生存率。结论:成功构建了可以有效治疗CD19^(+)肿瘤的基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域CART19细胞,为下一步临床治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体T细胞 CD19 突变型IgG4长铰链区 4-1BB共刺激域 白血病
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Interlayer Coupling of Co/NM/FM(NiFe and Co) Nano-Sandwich Films
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作者 马晓艳 毕晓昉 +1 位作者 宫声凯 徐惠彬 《Chinese Journal of Aeronautics》 SCIE EI CAS CSCD 2003年第4期253-256,共4页
Cu/Co, Cu/NiFe, Ta/NiFe bilayers and Co/Cu/Co, Co/Cu/NiFe, Co/Ta/NiFe sandwich films were deposited by a magnetron sputtering method. Magnetic properties were evaluated by VSM and spin valve magnetoresistance was inve... Cu/Co, Cu/NiFe, Ta/NiFe bilayers and Co/Cu/Co, Co/Cu/NiFe, Co/Ta/NiFe sandwich films were deposited by a magnetron sputtering method. Magnetic properties were evaluated by VSM and spin valve magnetoresistance was investigated by a four-probe method to study the interlayer coupling of the two magnetic layers. It has been found that the interlayer coupling depended not only on the layer thickness of the nonmagnetic spacer but also on the nature of the spacer. The interlayer coupling was reduced as the spacer layer thickness increased. The result was consistent with those from observations of the magnetic domain for the trilayers by means of Lorentz Electron Microscope. The trilayers with Cu spacer layer have shown a stronger coupling than those with Ta spacer layer. 展开更多
关键词 BILAYER TRILAYER interlayer coupling nonmagnetic spacer domain observation
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智能变电站系统方案探讨 被引量:5
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作者 张自民 文化宾 牛红星 《电气自动化》 2012年第4期1-4,共4页
智能变电站是智能电网中变换电压、接受和分配电能、控制电力流向和调整电压的重要电力设施,是智能电网"电力流、信息流、业务流"三流汇集的焦点,变电站智能化对建设坚强智能电网具有极为重要的作用。首先介绍了综合自动化变... 智能变电站是智能电网中变换电压、接受和分配电能、控制电力流向和调整电压的重要电力设施,是智能电网"电力流、信息流、业务流"三流汇集的焦点,变电站智能化对建设坚强智能电网具有极为重要的作用。首先介绍了综合自动化变电站、数字化变电站、智能变电站系统的特点、架构,在此基础上探讨了两种智能变电站系统方案,并对智能变电站系统的关键技术及目前存在的问题进行了分析和探讨。 展开更多
关键词 智能变电站 IEC61850 站控层 间隔层 过程层 电子式互感器 顺序控制 站域控制
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