SPD-TRAIL基因修饰间充质干细胞及其杀伤肺腺癌细胞的研究

目的通过基因工程手段构建了可高表达十二聚体TRAIL的间充质干细胞(MSC),以期为临床应用以MSC为载体的肿瘤靶向治疗提供新的实验方法。方法通过基因工程手段改造TRAIL基因序列,在其N-末端增加肺表面活性蛋白-D(SPD)结构域,使其形成稳定构象的十二聚体TRAIL蛋白,采用慢病毒载体基因转染间充质干细胞,得到可高表达TRAIL蛋白的SPD-TRAIL-MSC种子细胞。在此基础上对基因修饰细胞进行功能学检测。结果基因修饰后MSC流式表型、分化能力均未有显著变化;SPD-TRAIL-MSC及TRAIL-MSC(对照组细胞)均可高表达TRAIL蛋白,而SPD-TRAIL-MSC表达的TRAIL蛋白显著高于对照组细胞(P<0.001);通过肿瘤杀伤实验发现,SPD-TRAIL-MSC对肺癌细胞系A549具有更显著的增殖抑制(P<0.01)及促凋亡作用。结论SPD-TRAIL基因修饰的MSC可稳定高表达TRAIL蛋白,并对肺癌细胞系具有显著杀伤作用,为肺癌治疗提供了新的思路。

猪源耐大观霉素金黄色葡萄球菌中spd阳性新型质粒的鉴定

从重庆养猪场采集猪鼻腔拭子,采用含256 mg/L大观霉素的金黄色葡萄球菌显色培养基和BP培养基,结合生化试验、PCR和16S rRNA测序分离鉴定耐大观霉素金黄色葡萄球菌;提取分离株质粒,测定序列后分析其遗传背景;将提取的质粒电转化到金黄色葡萄球菌RN4220中,检测分离株及金黄色葡萄球菌RN4220的耐药性。结果显示,从106份鼻腔拭子中分离得到7株耐大观霉素金黄色葡萄球菌,仅1株金黄色葡萄球菌CQRC1携带大观霉素耐药基因spd,且该基因位于大小为5653 bp的新型质粒pCQRC1上。电转化pCQRC1质粒可提高金黄色葡萄球菌RN4220对大观霉素MIC值64倍以上。质粒pCQRC1测序分析发现其仅编码Rec、Rep、Spd和Pre/Mob 4个蛋白。质粒pCQRC1的出现可能会促进大观霉素耐药性的快速传播,这为大观霉素耐药性的风险评估提供了数据支持。

sPD-1和4-1BBL体内联合表达对小鼠实验性肝癌的治疗作用

目的探讨sPD-1和4-1BBL联合治疗肿瘤的效应和相关的免疫学机制。方法以H22肝癌细胞接种于BALB／c小鼠右后腿肌肉内,建立小鼠肿瘤模型;采用4-1BBL和可溶性PD-1(sPD- 1)真核表达质粒通过肌肉转染进行基因治疗;检测小鼠肿瘤生长情况,并检测转染基因及肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达,检测肿瘤组织中的淋巴细胞数量的变化。结果单独转染4-1BBL基因或sPD-1基因均显示出抗肿瘤作用,而联合治疗对肿瘤生长抑制作用更为明显,该组抑瘤率高达92．3％(以pcDNA3．1组为对照),显著高于4-1BBL组(78％)、sPD-1组(70．2％)。联合治疗不仅使TGF-β、IL-10的表达下调,而且在治疗后期更有效地促进IFN-γ和IL-2基因表达上调,且使瘤组织中CD8+T淋巴细胞数量较其他各组显著增加。结论4-1BBL和sPD-1联合治疗可使肿瘤微环境中的免疫相关基因表达更有利于抗肿瘤免疫应答,增强肿瘤免疫治疗效果。

采用sPD-1协同4-1 BBL进行肿瘤免疫基因治疗的研究

目的探讨采用sPD-1协同4-1BBL进行肿瘤免疫基因治疗的效果及相关的免疫学机制。方法以不同剂量的H22肝癌细胞接种于BALB/c小鼠右后腿肌肉内,建立小鼠肿瘤模型;采用可溶性PD-1 (sPD-1)和4-1BBL真核表达质粒体内转染进行基因治疗;观察接种不同剂量肿瘤细胞、不同治疗时间小鼠的成瘤率及肿瘤治疗效果;RT-PCR检测肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达;组织切片检测肿瘤细胞浸润肌肉组织的组织学变化;流式细胞仪检测脾脏细胞毒性T细胞(CTLs)的杀瘤效率。结果转染4- 1BBL/sPD-1基因治疗后,接种低剂量(1×10~4个/ml)H22肿瘤细胞的小鼠肿瘤生长完全受到抑制;接种高剂量(1×10~5个/ml)H22肿瘤细胞的小鼠肿瘤也受到显著抑制。通过延长基因治疗,荷瘤小鼠的成瘤率随着治疗时间的延长逐渐递减,至8周时成瘤率为0;基因治疗不仅促进IFN-γ和IL-2基因表达上调,而且也使TGF-β、IL-10的表达下调;瘤组织中CD8^+ T淋巴细胞数量增多和脾淋巴细胞的杀瘤效率显著增加。结论利用体内存在的少量肿瘤可作为抗原刺激淋巴细胞的激活;基因治疗适用于对手术、化疗、放疗后体内残存的少量肿增细胞的清除;当体内存在大量肿瘤细胞时,适当延长基因治疗时间可获得较好的治疗效果。

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的克隆刺五加亚精胺合成酶(spermidine synthase,SPDS)基因,并分析内生真菌对其表达的影响。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析。RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响。结果刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列。RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量(P<0.05),最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍。结论首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础。

可溶性PD-1及联合Hsp70-B16抗原肽复合物对小鼠黑素瘤肺转移的抑制作用

目的探讨黑素瘤肺转移小鼠模型体内表达可溶性PD-1(sPD-1)对B7-H1/PD-1信号传导的阻断作用,及联合Hsp70-B16抗原肽对小鼠黑素瘤肺转移的抑制作用。方法建立小鼠黑素瘤肺转移模型,应用免疫组织化学染色和流式细胞术检测肺转移灶PD-1及B7-H1的表达情况,从小鼠尾静脉注射sPD-1表达质粒,并联合应用Hsp70-B16抗原肽皮下免疫小鼠,于接种瘤细胞后第17天解剖小鼠,观察黑素瘤肺转移的情况,检测各组小鼠肺转移灶局部淋巴细胞浸润及部分免疫学指标。结果小鼠黑素瘤肺转移模型成功建立,肺转移灶局部有大量的PD-1阳性细胞,转移瘤B16细胞表面表达较多B7- H1分子,静脉注射sPD-1表达质粒联合抗原肽免疫治疗组小鼠肺转移明显受抑制,抑制率达95%,显著高于对照组,其对应组小鼠肺部CD8^+T淋巴细胞的数量、脾淋巴细胞的细胞毒活性及血清中的IL-2和IFN-γ的浓度均明显高于对照组(P<0.01)。结论小鼠体内转染表达sPD-1可阻断B7-H1/PD-1信号传导,抑制小鼠黑素瘤肺转移,联合应用Hsp70-B16抗原肽具有明显的协同作用。