微波辐射致小鼠GC-2spd细胞损伤效应研究

目的：探讨微波辐射对小鼠GC．2spd细胞的影响。方法：培养的GC-2spd细胞经平均功率密度为0、10、30mW／cm。微波辐射15min，于辐射后1-24h，应用MTF法、光镜、电镜、流式细胞术和ELISA法观测细胞增殖活力、细胞形态学和超微结构、细胞凋亡及cAMP含量的变化。结果：10、30mW／cm2微波辐射后1-24h（除30mW／cm2辐射后12h外），GC-2spd细胞增殖活力较对照组明显下降（P〈0．01或P〈0．05），光镜见部分细胞突起变短，数目减少，胞内空泡增多；辐射后6h，细胞凋亡率（％）明显增加（14．59±1．09、8．48±1．73傩4．56±2．09，P〈0．05或P〈0．01），电镜见细胞核染色质凝集边移或核膜破裂，内质网明显扩张；辐射后6h和24h，细胞内cAMP含量（nmol／g）明显降低（1．65±0．17、1．96±0．10 vs 2．77±0．24，2．13±0．33、1．69±0．27 vs 3．02±0．47，P〈0．05或P〈0．01）。结论：10和30mW／cm2微波辐射可引起GC-2spd细胞损伤，表现为细胞内cAMP含量降低，细胞增殖活力下降，细胞凋亡增加。

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯对GC-2spd细胞Bcl-2,Bax mRNA表达的影响

目的探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对GC-2spd细胞Bcl-2、Bax m RNA表达的影响。方法体外培养GC-2spd细胞,用不同浓度的DEHP(0、50、100和200μmol/L)染毒24 h。采用MTT实验检测细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光定量PCR法检测Bcl-2和Bax的m RNA表达。结果在DEHP染毒细胞24 h后,随着DEHP浓度(0、50、100和200μmol/L)的增加,细胞存活率逐渐下降,细胞凋亡率逐渐上升,Bcl-2 m RNA表达水平下降,Bax m RNA表达水平上升。结论 DEHP可能通过线粒体通路诱导GC-2spd细胞凋亡,进而影响雄性生殖功能。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对GC-2 spd细胞半胱氨酰天冬氨酸酶蛋白及mRNA表达的影响

目的探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)染毒对GC-2 spd细胞半胱氨酰天冬氨酸酶(caspase)蛋白及m RNA表达的影响。方法将体外培养的处于对数生长期的GC-2 spd细胞暴露于含终浓度为0(溶剂对照)、50、100、200μmol/L DEHP的培养基中培养24 h。采用Real-time PCR法检测细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 m RNA的表达,采用Western blotting法检测细胞caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)、procaspase-8、procaspase-9的表达。结果与溶剂对照组比较,100μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞caspase-3 m RNA的表达水平和200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞caspase-8 m RNA的表达水平及50、200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞caspase-9m RNA的表达水平均较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与溶剂对照组比较,100、200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞procaspase-3、procaspase-8、procaspase-9的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着DEHP染毒浓度的升高,GC-2 spd细胞procaspase-3、procaspase-8、procaspase-9的表达水平均呈下降趋势。结论 DEHP体外染毒可能通过启动caspase-8和caspase-9进而激活下游caspase-3级联反应,最终诱导生精细胞凋亡。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对GC-2 spd细胞FasL蛋白及mRNA表达的影响

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对GC-2 spd细胞FasL蛋白和mRNA表达的影响。方法将处于对数生长期的GC-2spd细胞,分别暴露于含终浓度为0(溶剂对照)、50、100、200μmol/L DEHP的培养液培养24 h。分别用q RT-PCR及Western blotting检测GC-2 spd细胞FasL mRNA和蛋白的表达。结果 100、200μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞FasL mRNA和蛋白的表达水平均高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05);且随着DEHP染毒浓度的升高,GC-2 spd细胞FasL mRNA和蛋白的表达水平呈上升趋势。结论 DEHP可能通过增强生精细胞FasL mRNA及蛋白表达,激活Fas/FasL信号通路,最终导致生精细胞凋亡。

邻苯二甲酸二乙基己酯对小鼠初级精母细胞氧化应激及凋亡的影响

目的研究邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对小鼠初级精母细胞(GC-2 spd)氧化应激及凋亡的影响。方法体外传代培养永生化的GC-2 spd细胞,用二甲基亚砜(DMSO)溶解DEHP,以DMSO浓度为0.1%的细胞孔作为对照组,用DEHP终浓度为50、100和200μmol/L的细胞孔作为低、中、高剂量组染毒24 h。分光光度计法测定GC-2 spd细胞丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,流式细胞仪检测不同剂量组细胞凋亡情况。结果与对照组比较,DEHP低、中、高剂量染毒组MDA含量依次升高,差异无明显统计学意义(P>0.05);SOD活力在DEHP高剂量染毒组下降,差异有统计学意义(P<0.05);DEHP低、中剂量染毒组GSH-Px活力明显下降,且差异有统计学意义(P<0.05)。DEHP中、高剂量染毒组细胞凋亡明显高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DEHP可通过诱发小鼠生精细胞氧化应激而诱导细胞凋亡。

淫羊藿苷对锰致小鼠精母细胞死亡的抑制作用

目的:研究淫羊藿苷对锰致小鼠精母细胞死亡是否具有抑制作用及最佳作用浓度,为淫羊藿苷治疗锰诱导的生殖损伤提供实验依据。方法:体外培养小鼠精母细胞GC-2spd(ts),分为空白对照组、阴性对照组、锰染毒模型组、淫羊藿苷干预组、淫羊藿苷组,MTT检测细胞活力。结果:50μmol/L淫羊藿苷可促进GC-2spd(ts)细胞增殖,0.05-5μmol/L淫羊藿苷对锰染损伤的小鼠精母细胞GC-2spd(ts)有修复作用。结论:淫羊藿苷对锰染损伤的GC-2spd(ts)细胞有修复作用,且0.5μmol/L淫羊藿苷作用效果最佳。

苯并[k]荧蒽(BkF)致雄性生殖细胞损害的初步研究

目的 建立高环多环芳烃的代表性化合物苯并[k]荧蒽(BkF)致小鼠精母细胞(GC-2spd)损伤模型,初步探讨BkF引起GC-2细胞的损伤效应及机制。方法 通过比较毒理基因组学数据库(Comparative Toxicogenomics Database, CTD)筛选与BkF相关的男性生殖系统疾病的基因,对其进行功能和通路富集,探索可能的通路机制。以终浓度为0、10、20、40、80μmol/L BkF处理GC-2细胞,检测细胞周期、氧化应激水平及DNA损伤效应,采用Western blot检测关键基因及相关通路核心分子的蛋白表达水平。结果 CTD数据库中筛选出与BkF相关生殖系统疾病的关键基因为CYP1A1和CYP17A1。GO富集分析发现其在男性生殖系统、细胞周期阻滞、氧化应激等生物过程中明显富集,KEGG富集分析发现其在细胞色素P450通路中富集明显(P<0.01)。BkF染毒GC-2细胞72 h后,细胞增殖活力较对照组明显下降,且存在剂量-效应关系。染毒剂量高于40μmol/L后细胞周期阻滞明显(P<0.05),且染毒组细胞内ROS水平(P<0.05)、DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白表达量(P<0.01)呈剂量依赖性增加。与对照组相比,染毒组细胞CYP1A1和CYP17A1的蛋白表达显著增加(P<0.05)。加入AhR抑制剂CH223191后,染毒组CYP1A1和CYP17A1的表达明显下调(P<0.05)。结论 BkF通过诱导AhR受体激活,引起下游基因CYP1A1和CYP17A1的表达升高、细胞内ROS增加,从而导致GC-2细胞氧化应激,造成遗传损伤。

氯化镉引起线粒体分裂诱导小鼠精母细胞GC-2 spd凋亡

目的探讨镉诱导小鼠精母细胞(GC-2 spd)凋亡的作用机制。方法于2021年3月,分别用5和10μmol/L氯化镉(CdCl_(2))染毒GC-2 spd细胞24 h,分别为CdCl_(2)5μmol/L染毒组(CdCl_(2)低剂量组)和CdCl_(2)10μmol/L染毒组(CdCl_(2)高剂量组),以未染毒的GC-2 spd细胞作为对照组。采用Mito-Track Red CMXRos线粒体荧光探针染色细胞检测线粒体形态,流式细胞术结合JC-1荧光探针检测线粒体膜电位的变化;使用细胞线粒体分离试剂盒和RIPA裂解液分别提取GC-2 spd细胞的线粒体蛋白、细胞浆蛋白和细胞总蛋白,Western blot检测线粒体稳态调节蛋白[分裂蛋白(FIS1)和融合蛋白(OPA1)]及细胞凋亡相关蛋白(Cytochrome c和cleaved Caspase-3)的表达。结果与对照组细胞比较,CdCl_(2)低剂量组和高剂量组细胞中JC-1红色/绿色荧光信号相对比值均明显降低(0.740±0.071、0.570±0.028),差异有统计学意义(P=0.017、0.004);线粒体形态由长管状变为点状,含点状线粒体的细胞比例明显升高(45.1%±3.7%和25.7%±4.9%),差异有统计学意义(P=0.005、0.001);CdCl_(2)低、高剂量组细胞中线粒体FIS1相对表达水平均明显升高(1.271±0.120、1.693±0.155),差异有统计学意义(P=0.046、0.000);OPA1相对表达水平明显降低(0.838±0.050、0.682±0.040),差异有统计学意义(P=0.049、0.001)。与对照组细胞比较,CdCl_(2)低剂量组细胞的胞浆中Cytochrome c蛋白相对表达水平(1.249±0.151)差异无统计学意义(P=0.075),然而CdCl_(2)高剂量组细胞胞浆中其相对表达水平明显升高(2.355±0.110),差异有统计学意义(P<0.001);CdCl_(2)低、高剂量组线粒体中Cytochrome c相对表达水平均明显降低(0.681±0.043、0.619±0.114),差异有统计学意义(P=0.004、0.001);细胞中cleaved Caspase-3蛋白水平升高(5.486±0.544、11.493±1.739),差异有统计学意义(P=0.004、<0.001)。结论CdCl_(2)可促进线粒体分裂,影响Cytochrome c蛋白在GC-2 spd细胞内分布并激活Caspase-3蛋白活性,引起细胞凋亡。