血红素加氧酶-1基因转染对非协调性异种心脏移植物的影响

目的观察血红素加氧酶-1(HO-1)基因转染对非协调性异种心脏移植物的影响,并探讨其可能的保护机制。方法采用颈部袖套血管吻合法联合应用中华眼镜蛇毒因子(CVF)建立稳定的豚鼠-SD大鼠非协调性异种异位心脏移植模型。供体豚鼠和受体SD大鼠各24只,每组各8只随机配对分为Ⅰ组(对照组)、Ⅱ组(空白载体组)和Ⅲ组(HO-1基因转染组),分别在供心冷缺血期间经冠状动脉缓慢灌注单纯的HTK液、含腺病毒空白载体的HTK液和含有HO-1基因的腺病毒表达载体HTK液,供心复跳后观察其存活时间;供心停跳后取心肌组织行病理学检查,RT-PCR检测目的基因的表达情况,免疫组织化学染色进行定性和定位分析。结果 RT-PCR检测证实异种移植心脏外源性HO-1基因转录;免疫组织化学染色证实目的基因表达蛋白在移植心脏血管周围心肌细胞以及冠状动脉微血管内表达。HO-1表达的移植心脏炎症细胞浸润明显减少,巨噬细胞和NK细胞浸润明显减少,心肌细胞凋亡减少,移植心脏平均存活时间[n=8,(40±3)h]与空白载体组[n=8,(21±2)h,P<0.01]和对照组[n=8,(20±3)h,P<0.01]相比明显延长。结论在供心离体期间,经冠状动脉缓慢灌注腺病毒表达载体介导HO-1基因进行基因转染,可以使保护性功能基因HO-1在移植心脏成功转录并表达其相应的功能蛋白,从而保护异种移植物减轻免疫损害,延长异种移植心脏的存活时间,为进一步的临床应用提供实验依据。

PAMAM-D对异种移植用外源基因转染猪精子细胞介导作用的研究

目的:探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状聚合物PAMAM-D对异种移植用外源基因人衰变加速因子(hDAF)转染猪精子细胞的介导作用。方法:制备PAMAM-D/hDAF cDNA复合物,分为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg组,每组cDNA再按照氮磷比10:1、20:1、40:1分别加入相应剂量PAMAM-D及不加PAMAM-D,对复合物进行酶切和电泳;将复合物与猪精子细胞共孵育后,原位杂交法检测hDAF对猪精子细胞的转染效率。结果:PAMAM-D能阻止PAMAM-D/DNA复合物中DNA的降解;PAMAM-D可以促进猪精子细胞对外源性DNA的摄取,其中0.4和0.6μg组的转染效率高于其他3组,0.4μg线状质粒加入PAMAM-D(氮磷比20:1)转染率为(47.5±0.2)%,是不加PAMAM-D的167%。结论:以PAMAM-D为载体可以提高外源基因对猪精子细胞的转染效率,有助于外源基因与精子细胞的稳定结合。

CTLA4-Ig抑制异种混合淋巴细胞反应

目的 研究共刺激分子细胞毒性T细胞抗原 4(CTLA4)对人 -猪异种移植反应中 ,T细胞活化的抑制作用。方法 用转染CTLA4 Ig融合基因的猪血管内皮细胞系 (PIEC)和CTLA4 Ig融合蛋白抑制T细胞增殖反应。结果 B7/CD2 8共刺激信号途径在异种细胞排斥反应中起重要作用 ,CTLA4 Ig的抑制效应没有对同种细胞反应的影响强。 结论 上述结果的机制可能是因为异种间分子不相容性降低协同分子的匹配性 ,或者异种移植反应中其它协同分子“替代性”

经hCTLA4-Ig基因转染的猪胰岛细胞在小鼠体内的存活与功能状况研究

目的研究将人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(hCTLA4-Ig)基因转染至猪胰岛细胞后,再将其移植至小鼠体内的存活及功能状况。方法采用腺相关病毒载体(AAV)介导hCTLA4-Ig基因体外转染新生猪胰岛细胞(NIPs),再将转基因的NIPs移植至构建了人免疫系统的SCID糖尿病小鼠左肾被膜下。逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应和免疫荧光染色法检测转染后hCTLA4-Ig基因的表达状况;观察小鼠移植转基因NIPs后的生存时间;移植物免疫组织化学分析及酶联免疫(ELISA)法测定受者血清中细胞因子的水平。结果NIPs经转染后,可检测到hCTLA4-Ig基因及其蛋白表达,且葡萄糖刺激胰岛素释放试验与未转染的对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);糖尿病小鼠经转基因的NIPs移植后,生存时间及血糖维持正常的平均时间分别为(72.5±30.6)d和(59.1±24.0)d,较未转染的对照组(26.9±6.9)d和(12.7±3.3)d显著延长(P<0.01);免疫组织化学染色检测移植后不同时间(15、30、90d)的移植物组织,可见转基因细胞移植部位有完整的胰岛细胞,而对照组胰岛细胞破坏、消失,周围可见较多的炎性细胞浸润;且转基因细胞移植的小鼠血清白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平明显低于对照组(P<0.05)。结论AAV介导hCTLA4-Ig基因体外转染猪胰岛细胞后再移植至受者体内,可提高受者的免疫耐受水平,延长胰岛细胞在异种受者体内的存活时间,而胰岛细胞的内分泌功能不受明显影响。