新型生物高分子——三赞胶研究进展

三赞胶是我国首个自主研发的鞘氨醇胶,具有良好的成凝胶特性、假塑性、增稠性和乳化活性,在食品添加剂和石油工业等领域具有广泛应用价值。本文系统概述了三赞胶的结构、功能特性、合成机理、发酵生产以及应用领域等方面的最新进展,讨论了三赞胶生产中存在的问题及改进建议,以期为三赞胶的深入研究提供理论支撑,为三赞胶产业的进一步发展提供参考。

鞘氨醇胶Ss胶凝条件及质构特性的研究

对鞘氨醇胶Ss形成凝胶的条件及凝胶的质构特性进行研究。结果表明:在Ca2+存在的条件下,Ss胶凝的临界浓度为0.15%,温度为70℃。在1%的浓度范围内,凝胶硬度、弹性和黏附性等质构参数随Ss浓度增大而增加,随pH的增加而减小。在鞘氨醇胶Ss水溶液中加入Ca2+能显著提高凝胶的硬度和弹性,在0.6%Ss溶液中加入2 mmol/L Ca2+,凝胶黏附性可提高30%;加入10 mmol/L Ca2+,凝胶硬度和弹性增加最多,分别达到17.73 g和20.24 g.s,是对照的2.78和2.61倍。

鞘氨醇胶Ss的降解及抗氧化活性的研究

对鞘氨醇胶Ss进行氧化降解,得到重均分子量为10.3ku的降解产物,利用红外光谱和核磁氢谱对降解产物进行结构表征,并对其抗氧化性进行测试。结果表明,降解处理后鞘氨醇胶Ss的抗氧化性显著提高,氧化降解24h的样品还原力最高,降解产物清除羟自由基的IC50为8.32mg/mL,清除超氧阴离子的IC50为12.13mg/mL。

鞘氨醇单胞菌TP-3中基因spsK的克隆及生物信息学分析

以自杀性质粒pUT携带的mini-Tn5转座子对菌株TP-3进行转座诱变,从转座突变库中筛选到不能合成产物鞘氨醇胶Ss的突变株,进而采用Tn5外向扩增与LP-RAPD相结合的方法,得到糖基转移酶编码基因spsK的801 bp序列全长。生物信息学分析表明,其氨基酸序列与迪特胶以及S88合成途径中的糖基转移酶同源性最高,达47%;SpsK蛋白具有典型的G-loop和DXD保守模式,属于糖基转移酶的GT-A家族。

合成生物聚合物的重要微生物资源-鞘氨醇单胞菌

鞘氨醇单胞菌属的许多菌株能够合成结冷胶、沃仑胶、迪特胶等多种结构相似,物理性能多样的生物聚合物,统称为鞘氨醇胶。目前,结冷胶已经大规模的生产和应用,由于鞘氨醇单胞菌属的提出仅有十几年的历史,其他种类鞘氨醇胶的研究和开发才刚刚起步。本文综述了鞘氨醇单胞菌属分类研究的最新进展,以及鞘氨醇胶的结构、特性、生物合成途径、分子遗传学和基因工程的研究现状,并对今后的研究重点和方向进行了展望。

LB克隆系统的构建及在鞘氨醇单胞菌基因融合表达中的应用

为摆脱限制性酶切位点不足的限制,构建可灵活改变多基因融合方向的表达载体,基于IIS型和IIT型限制性内切酶LguⅠ和BbvCⅠ设计开发了LB克隆系统。该克隆系统是以广宿主质粒pBBR1MCS-3为初始载体,利用PCR的方法,在其多克隆位点区插入LB片段(GCTCTTCCTCAGC)构建得到的。LB片段含LguⅠ和BbvCⅠ部分重叠识别位点,经这两种限制性内切酶酶切后可以产生相同非回文序列,利用这一性质可快速、灵活地将多个基因逐步、定向插入表达载体。为验证该克隆系统的有效性,将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)WG中两个糖基转移酶基因welB、welK逐步定向融合至LB克隆载体,并将重组质粒转入鞘氨醇单胞菌中表达。结果表明,基因融合表达对鞘氨醇胶产量影响较小,但是,对鞘氨醇胶粘度有重要影响。在发酵84 h时,重组菌株Sphingomonas sp.WG/pBBR1MCS-3-LB-welKB的发酵液粘度较野生株提高约24.7%,粘度提升将有助于该鞘氨醇胶在石油开采、食品等多个领域的应用。综上所述,以鞘氨醇单胞菌为研究对象,验证了LB克隆系统在多基因融合中的应用,为构建融合酶提供了一种高效的方法。

菌株TP-3中基因pgmG的克隆、表达及酶活性分析

目的:克隆得到鞘氨醇单胞菌TP-3的葡萄糖磷酸变位酶基因全长,表达并验证其酶活性,为下一步菌株TP-3的基因工程改造奠定基础。方法:利用Tail PCR的方法扩增得到菌株TP-3的pgmG基因全长,通过pET-28a(+)大肠杆菌表达系统表达目的基因,优化诱导表达条件,并测定酶活性。结果:扩增得到1 383bp的pgmG基因全长,编码460个氨基酸,诱导表达后得到一个分子量约为49.8kDa的目的蛋白,纯化后的酶活为5 985 U/g。结论:首次得到新菌Sphingomonas sanxanigenenssp.nov.TP-3的pgmG基因全长,其编码蛋白PgmG与温轮胶合成菌Sphingomonas sp.NX-3的葡萄糖磷酸变位酶同源性最高,达81%,在大肠杆菌中表达目的基因并验证了葡萄糖磷酸变位酶活性,经Ni-NTA纯化后酶收率为29.3%。