新型杀虫剂Spinosad产生菌株的诱变选育

对spinosad产生菌Saccharopoly,Spora,Spinosad508,采用离子束辐照和亚硝基胍(NTG)诱变相交替的办法,选育得到一突变株,其发酵水平较原始菌株提高了140%。

多杀菌素生产菌的复合诱变选育及发酵优化

生物农药多杀菌素的发酵水平限制了其产业化发展。为了提高多杀菌素产量,以刺糖多孢菌T1(Saccharopolyspora spinose T1)为出发菌,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)诱变,并以链霉素和鼠李糖作为筛选因子结合微孔板培养进行筛选,获得高产菌株S.spinosa F5;发酵后其多杀菌素产量为572.3 mg/L,比出发菌提高35.9%;通过单因素实验和响应面实验确定柠檬酸钠、异亮氨酸的最适添加量分别为0.46、0.10 g/L,豆油的最适添加体积分数为1.77%,此时多杀菌素产量为707.2 mg/L。在5 L发酵罐中进行分批发酵,发酵240 h产量接近800 mg/L;进一步分批补料发酵264 h,多杀菌素产量达1175.5 mg/L。结果表明,ARTP和DES复合诱变育种及添加外源诱导物可以显著提高多杀菌素产量。

5%多杀菌素油悬浮剂的研制

筛选一种具有可分散性的质量分数为5%的多杀菌素油悬浮剂配方.采用湿法研磨工艺,使用实验室立式砂磨机、激光粒度仪对配方中分散介质、乳化剂、分散剂和结构调整剂及其用量分别进行筛选.采用矿物油作为油相介质,其在增加多杀菌素油悬浮剂稳定性的同时起到增效的作用.在上述方法下,对多杀菌素可分散油悬浮剂进行优化,优化配方为:多杀菌素原药5%(质量分数,以下同),矿物油乳化剂10%,AEO-7乳化剂2%,P6分散剂4%,869结构调整剂3%,分散介质矿物油76%.筛选得到的多杀菌素可分散油悬浮剂,经过冷热贮稳定性测定,其各项指标均符合油悬浮剂的标准.

多杀菌素生产菌株发酵配方及条件的优化

以多杀菌素产生菌C121菌株为试验菌株进行发酵培养基的研究,探索不同碳源、氮源对多杀菌素生物合成的影响。经L18(37)正交筛选试验,最终筛选到一个发酵培养基的最佳配方。用菌株C121进行摇瓶发酵条件试验的结果表明:当500 mL三角瓶中装料40 mL,消前pH 7.0,转速为210 r/min,温度为30℃时是最佳发酵条件,其发酵效价达到586μg/mL。

多杀菌素产生菌的高通量诱变选育

目的利用高通量筛选方法进行刺糖多孢菌诱变选育获得多杀菌素高产菌株。方法以ASAGF73为出发菌株,通过亚硝基胍(NTG)诱变,并利用96孔板发酵培养结合快速生物测定进行高通量筛选。结果诱变剂量为2mg/mL,诱变时间50min时突变株多杀菌素产量有较大幅度提高。通过3轮复筛验证最终获得8株产量分别比出发菌株提高了43.94%、33.76%、29.41%、28.61%、27.40%、26.42%、25.59%和20.40%的突变株。结论利用高通量筛选方法可以快速获得多杀菌素高产菌株。

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明:96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60h,每孔发酵培养基装液量为0.4mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。

2.5%多杀菌素悬浮剂配方的研制

通过正交优化法得到2．5％多杀菌素悬浮剂的最佳配方：多杀菌素原药2．5％，D-4251．83％， WP-0036．17％，乙二醇4．5％，硅酸镁铝1．5％，消泡剂6300．2％，蒸馏水补足至100％。加工工艺研究发现：使用立式砂磨机，锆珠的最佳用量（ml）是制剂体积（ml）的2．0倍，最佳研磨时间为1．5 h，得到的悬浮剂在pH值6．8～7．0条件下，（54＆#177;2）℃热贮14 d，无析水、分层现象，悬浮率＞85％，倾倒性合格，产品各项指标符合悬浮剂的要求。

MPMS诱变结合抗生素抗性选育多杀菌素高产菌株

采用多功能等离子体诱变系统(MPMS)对菌株ASAGF 13-8-1进行诱变,并通过链霉素、庆大霉素、利福平、氯霉素四种抗生素抗性筛选多杀菌素高产菌株。利用96孔板发酵培养结合生物检测的快速方法进行高产菌株高通量初筛,摇瓶发酵进行复筛。通过5轮复筛验证,获得1株产量较出发菌株提高28.68%且遗传稳定的突变菌14-2。比较MPMS诱变和MPMS诱变结合0.9μg/mL链霉素、14μg/mL庆大霉素、400μg/mL利福平、2μg/mL氯霉素的四重抗性筛选对出发菌株ASAGF 13-8-1的作用效果,结果显示MPMS诱变结合抗生素抗性筛选更有利于多杀菌素高产菌株的选育。

组合抗生素抗性选育多杀菌素高产菌株

通过2种途径向菌株ASAGF W2引入链霉素、庆大霉素、利福平和氯霉素抗性,研究抗生素抗性筛选技术对选育多杀菌素高产菌株的作用效果。途径一是将4种抗生素的抗性通过含有抗生素的平板逐级引入,标记为非GYM组;途径二是将分离得到的抗性突变菌进行纯培养后通过抗生素平板引入下一种抗性,标记为GYM组,利用摇瓶发酵进行多杀菌素高产菌株的选育。结果显示非GYM组的方法是进行抗生素抗性筛选的较适途径;通过对高产菌株连续转接5次,最终获得4株遗传稳定的高产突变菌,其中突变菌13-8-1来自非GYM组,具有Str^(0.5)Gen^(10)双重抗性,多杀菌素平均发酵产量较出发菌株ASAGF W2提高了23.87%。利用抗生素抗性筛选技术选育多杀菌素高产菌株,简单易行且效果显著。

多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化

目的利用诱变结合抗性筛选方法选育多杀菌素高产菌株,并通过发酵培养基优化进一步提高多杀菌素产量。方法分别确定链霉素、安普霉素和鼠李糖3种抗性的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),然后以S.s1-4为出发菌株,通过紫外(UV)结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子诱变选育,在此基础上利用亚硝基胍(NTG)结合上述抗性因子诱变选育,并利用响应面实验设计对发酵培养基中葡萄糖、糊精、棉籽蛋白3种成分进行优化。结果出发菌株经过紫外照射30s,涂布于抗性平板上,筛选得到S.s2-21,S.s2-21再用NTG处理30min,涂布于抗性平板上,最终获得1株遗传性状稳定的菌株S.s3-37,产量为78.26mg/L,提高了45.71%;发酵培养基优化后,其产量达83.00mg/L。结论利用紫外和NTG结合抗性复合诱变选育获得多杀菌素高产菌株是有效的,通过发酵培养基优化,其产量较出发菌株提高了54.55%,获得良好的效果。

多杀菌素生产菌诱变选育的研究进展

多杀菌素是一种由刺糖多孢菌产生且具有优秀抗虫活性的生物农药。目前多杀菌素产量普遍较低,而提高其产量的关键之一是选育高产菌株。尽管刺糖多孢菌全基因组序列已完成解析,但由于多杀菌素生物合成途径的复杂性及对其调控机制认识的匮乏性,构建高产基因工程菌株依然存在很大困难。利用诱变技术选育多杀菌素高产菌株,是一种有效便捷的方法。除了传统的物理化学诱变外,新型诱变育种技术如核糖体工程、等离子体技术、基因组重排、航天诱变育种等在高产菌株选育中都发挥了重要作用。本文综述了近年来相关研究,阐述了高通量筛选技术,并对其未来的研究方向进行展望。

基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%~15%增加至30%~35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl 1215-5和Gen 1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。