四种cry基因启动子在spoIIID基因突变株中的活性比较

【目的】分析spoIIID基因突变对苏云金芽胞杆菌cry1、cry3、cry4和cry8基因启动子Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E的影响,比较以上启动子在无芽胞spoIIID基因突变体(HD-△SpoIIID)中的转录活性。【方法】分别构建了Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合的转录分析载体,并导入HD-73野生型菌株和HD-△SpoIIID突变株中测定β-半乳糖苷酶活性;通过高温诱变方法在HD-△SpoIIID基础上筛选出缺失cry1Ac基因的HD--△SpoIIID突变体;构建了4种启动子与cry1Ac基因融合表达载体,分别将它们转入HD-ΔSpoIIID和HD--ΔSpoIIID中,分析Cry1Ac蛋白表达量及其生物活性。【结果】HD-73和HD-ΔSpoIIID菌株中四个启动子转录活性由高到低分别为:Pcry8E>Pcry1Ac>Pcry4A>Pcry3A;spoIIID基因的缺失未影响Pcry1Ac和Pcry8E转录活性,Pcry3A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性略有升高,Pcry4A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性在T5到T10略有降低。从翻译水平来看在HD-ΔSpoIIID中cry8E启动子略低于cry1Ac启动子,并高于Pcry4Aa,Pcry3A指导的Cry1Ac蛋白产量,生物活性测定结果与蛋白表达量相符。【结论】cry8E基因启动子Pcry8E在spoIIID突变体中在转录水平活性是最高的启动子,而cry1Ac启动子指导自身基因cry1Ac表达时,在翻译水平上略高于cry8E启动子指导的Cry1Ac产量。

胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变筛选研究

通过链霉素对南昌霉素 (Nanchangmycin)产生菌NS 41 80菌株孢子的致死浓度测定基础上 ,采用诱变剂甲基磺酸乙酯 (EMS)的不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含链霉素 ( 1 0 μg/mL)致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。然后从 3,0 0 0株链霉素抗性基因 (str)突变株中通过初筛获得比诱变出发菌株产素能力提高 2 0 %以上的菌株 2 0 2株。再进一步通过摇瓶复筛 ,获得比出发菌株产素能力分别提高 1 0 0 %、 2 0 0 %和 30 0 %高产菌株为 48株 ,7株和 1株 ,分别为复筛菌和初筛菌株的 2 3 76%和 1 60 % ;3 46%和 0 2 3% ;0 5 %和 0 0 3%。将产素能力提高 2 4 0 %以上 5个菌株连同出发菌株连续 3批次进行摇瓶发酵结果 ,5个突变株的产素能力均比出发菌株的产素能力提高 5 7%～ 96 4% ,其中突变株 80 5 3 1 65菌株摇瓶发酵单位达 6,0 0 0 μg/mL以上 ,3批次摇瓶平均发酵单位达 5 ,85 5 μg/mL。建立了南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变快速高效的筛选方法。

梅岭霉素高产菌株链霉素抗性基因突变株筛选

通过链霉素对梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 41 80菌株孢子致死浓度的测定 ,采用诱变剂EMS 4种不同剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,然后涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。并进一步筛选到梅岭霉素高产菌株 80 5 1 1 2 2 1 ,在摇瓶条件下 ,只产梅岭霉素不产南昌霉素 ,梅岭霉素活性单位达 1 ,52 1 μg/mL,比NS 41 80的摇瓶发酵单位 855μg/mL提高了 77 9% ,该菌株连续传 6代进行摇瓶发酵 ,其F2 代和F3 代发酵单位稳定 ,F4代至F6 代随着代数增加 ,梅岭霉素发酵单位急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和str突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产量突变密切相关。产量突变的EMS剂量高于str突变剂量 ,从而建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法。

焦磷酸测序技术在确认北京严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株并检测基因突变中的应用

结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法。从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PyrosequencingTechnology,PSQ)进行第2601、79199、4791、9838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7919位碱基发生了A/G突变。PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点。利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源。

BALB/c鼠口服免疫猪水肿病大肠杆菌基因突变菌株的免疫效果

为了研究猪水肿病(ED)大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用已构建的猪ED大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株口服免疫BALB/c小鼠,检测其血清中的IgG抗体及粪便和肠黏液中的sIgA抗体水平,并进行淋巴细胞增殖检测及攻毒保护实验。结果表明该基因突变菌株具有良好的免疫性,能诱导小鼠体内产生IgG和sIgA抗体,并且能引起T淋巴细胞增殖反应。攻毒保护实验结果显示,口服免疫突变菌株能对小鼠提供良好的保护,保护率为75%(15/20)。本研究结果证明,该大肠杆菌基因突变菌株在小鼠体内能激发体液免疫和细胞免疫反应,可作为猪ED口服疫苗的候选菌株。

临床分离铜绿假单胞菌喹诺酮耐药株gyrA基因突变及其对β-内酰胺类药物敏感性研究

利用 PCR、限制性片段多态性分析 (RFL P)、DNA单链构像多态性分析 (SSCP)和 DNA测序等方法 ,对 10株成都地区临床分离耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌 gyr A基因进行研究。结果表明 ,成都地区耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌 gyr A的喹诺酮耐药决定区编码第 83位氨基酸密码子表现出高频单点突变 (10株中有 8株 ) ,其突变方式为 ACC→ATC。gyr A的 PCR扩增产物 Sac II酶切片段与测序结果一致。SSCP的带谱与测序结果比较 ,除 1株 (PSA2 )的 SSCP带谱与标准株相同 ,但测序结果有点突变外 ,其余菌株与测序结果一致。因此 ,利用 PCR- SSCP- RFL P系统 ,可快速、准确的检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌 gyr A中至少一个碱基的差异。用二倍稀释法测定喹诺酮和 β-内酰胺类药物对耐药突变株体外抗菌活性 ,结果表明 ,铜绿假单胞菌 gyr A基因突变株对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和哌拉西林表现出不同的敏感性。试验所用 8株突变株对诺氟沙星和环丙沙星表现出高水平抗性 ;3株对左氧氟沙星敏感 ;3株对头孢他啶和哌拉西林表现出耐药 ,2株对亚胺培南耐药。

武汉地区耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株katG基因突变的分子特征分析

结核病是由Mtb感染所致的慢性传染性疾病。近年来，随着MDR和XDR的不断产生，结核病以更严峻的形式威胁着人类的健康。异烟肼（isoniazid，INH）是一个不可或缺的抗结核一线药物。文献报道，异烟肼耐药主要与katG基因突变密切相关。

金黄色葡萄球菌临床分离耐氟喹诺酮类药物株的gyrA和grlA基因突变

对 5株临床分离的耐氟喹诺酮类药物的金黄色葡萄球菌 (MIC值范围 :4～≥ 12 8mg/ L) ,提取各细菌染色体DNA,对 gyr A和 grl A基因进行 PCR扩增 ,产物与 p MD18- T载体连接 ,转化至大肠杆菌 JM10 9感受态细胞 ,筛选阳性克隆 ,测序。序列分析结果表明 ,5株菌均发生了基因突变。突变位点 grl A:Ser80 (TCC)→ Phe(TGC) ,Ser80 (TCC)→ Tyr(TAC) ;gyr A:Ser84 (TCA)→ L eu(TTA )、Ser84 (TCA)→ Ala(GCA)、Glu88(GAA)→ L ys(AAA) ,其中 2株对氟喹诺酮类药物的 MIC值低 (4～ 6 4 m g/ L) ,均发生 grl A单一点突变 ,其余 3株在 gyr A和 grl A上产生多突变位点 ,且对氟喹诺酮类药物的 MIC值较高 (8～≥ 12 8mg/ L )。说明单一的点突变只能引起低水平或中等水平的耐药 ,高水平的耐药需要多位点的突变。 5株耐药菌株均发生 grl A Ser80→ Tyr(Phe)点突变 ,提示环丙沙星、诺氟沙星等氟喹诺酮类药物作用于金黄色葡萄球菌的首要靶酶是拓扑异构酶

一株多重耐药大肠杆菌耐喹诺酮gyrA基因突变的研究

临床获得 1株鸡致病性大肠杆菌CE0 1,进行药敏、质粒转化、耐药质粒消除试验 ,结果该菌对 11种受试抗菌药物全部呈高度耐药 ,其中氧氟沙星的MIC≥ 5 0 μg/ml,且含有喹诺酮抗性质粒 ,溴化乙淀和黄连素作为消除剂作用 48小时可使其喹诺酮抗性质粒消除 ,耐药水平显著下降。聚合酶链反应 (PCR)扩增该菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区 (QRDR) ,质粒DNA和染色体DNA均可扩增出长度为 6 6 8bp的PCR产物片段。经测序分析 ,两者基因序列相同率为 98.17%,相同位点突变相同的碱基有 5个 ,相同位点突变不同的碱基有 2个 ;与基因数据库Swanberg等报道的大肠杆菌gyrA基因相应序列比较 ,该菌质粒DNAPCR产物同源率 97.8%,有 13个位点发生突变 ,3个氨基酸被替换 ;染色体DNAPCR产物同源率 98%,有 12个位点发生突变 ,2个氨基酸被替换。用放射性同位素α_3 2 P分别标记CE0 1菌株染色体DNA和质粒DNA的PCR扩增片段制备探针 ,对CE0 1菌株进行检测。质粒DNA和染色体DNA分别与质粒探针和染色体探针杂交出现典型的阳性杂交斑。证实该菌株质粒和染色体上同时存在耐喹诺酮gyrA突变基因 ,对喹诺酮的耐药性是质粒介导和染色体突变共同作用的结果。

单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV—1)基因突变株的生物学特性初步研究

应用病毒空斑滴定法及动物LD_(50)法对HSV-1基因插入突变株[HSV-1(RC)]的生物学特性进行了初步研究。发现HSV-1(RC)株在不同的6种细胞系上能够生长繁植,但在BHK-21、Hep-2细胞上较其亲代HSV-1(Δ305)及HSV-1(F)株生长缓慢,且空斑形成单位(pFU)数明显低于亲代株。动物LD_(50)实验结果HSV-1(F)株LD_(50)值为2.9×10~4pFU/0.1ml,而HSV-1(6305)及HSV-1(RC)LD_(50)值为0。实验结果提示:HSV-1基因组BamHI C片段插入突变处不是该病毒在一些细胞培养上生长所必需的基因片段,但对在某些细胞系上的生长仍具有影响作用。HSV-1的TK基因和BamHI C片段插入突变处则是病毒在动物整体上毒力强度的必需基因。在HSV-1基因组BamHI C片段处插入9.7kb大小的外源基因并不影响病毒在细胞上的组装和繁殖,但其毒力降低,建立的实用空斑滴定技术适用于病毒学研究,有推广应用价值。

亚硝基胍诱变巴氏杆菌基因突变株的生长表现及其毒性试验

亚硝基胍诱变巴氏杆菌基因突变株的生长表现及其毒性试验１）胡永浩汪清曾巧英于风刚沈正达（甘肃农业大学动物医学系兰州７３００７０）微生物分子遗传学研究表明，病原菌通过诱变使ＤＮＡ分子结构中的某一位点发生改变而形成基因突变菌株。基因突变的类型多种多样，营养...

乙型肝炎病毒前C基因突变株与暴发性肝炎

乙型肝炎病毒(HBV)感染的临床表现复杂而多样,感染HBV后血清中可出现多种标志物.血清中HBeAg阳性转为抗-HBe阳性是否代表病毒复制减弱?抗-HBe阳性肝炎患者为什么还会出现慢性化、重症化趋向?一直是临床上急待解决的问题.近年来,有关HBV前C基因突变的报道较多,并发现前C基因突变株感染在乙型肝炎慢性化及重症化甚至发展为暴发性肝炎(FH)中起重要作用.本文就前C基因突变株与FH的问题作一概略综述.

变形链球菌GS-5菌株gbpC和pac基因突变的检测

变形链球菌gbpC基因编码的葡聚糖结合蛋白C(GbpC)和pac基因编码的Pac属于G^+胞壁结合蛋白。GbpC与葡聚糖(α-1,6葡聚糖)依赖性聚集(ddag)有关。

山东省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的分析山东省利福平耐药结核菌株rpoB基因突变特点。方法本研究为回顾性调查,135株样本分别取自1997、2000及2003年的流行病学调查和医院的临床样本。采用PCR直接基因测序法分析rpoB基因突变。结果135株结核菌中,60株为利福平耐药菌株,其中55株(91.7%)rpoB基因的利福平耐药决定区(RRDR)有突变。突变频率依次为密码子531(60.0%),526(29.1%)和516(7.3%)。1株耐药菌同时发生了少见的3个密码子(511,515,518)的多核苷酸突变。75株敏感菌株中,仅3株(4.0%)有突变,均发生在密码子533,包括一个新发现的突变基因型CTG(Leu)→ATG(Met)。结论来自山东省结核菌中,利福平耐药表型与rpoB基因突变的符合率为94.1%,并提示密码子533突变与利福平耐药表型相关性较低。

培养的人癌细胞株(系)pot1基因exon12突变筛选

目的对培养的人癌细胞株(系)中pot1(protectionoftelomeres1)基因exon12进行突变筛选。方法从27株培养的人癌细胞株(系)提取染色体组DNA,用PCR方法扩增hpot1基因exon12,PCR产物纯化后直接测序,测序结果与GenBank和NCBI数据库中pot1基因的数据比较,对培养的人癌细胞株(系)中hpot1基因exon12进行突变分析。结果测序结果显示,人宫颈癌Hela细胞株和人卵巢癌细胞株(高转移)HO8910-PM等5个来源于女性生殖系统癌细胞株中的4个,在hpot1基因exon12区有相同的置换突变(G17722→C),为错义突变,对应于cDNA的G1385→C,多肽链的Leu454→Phe;而其余23个不同来源的癌细胞株(系)均无突变。结论提示hpot1基因exon12(17722碱基)是突变热点区,并且这种突变可能具有女性生殖系统肿瘤特异性。

PCR-SSCP快速检测结核分支杆菌rPOB基因突变

结核分支杆菌的耐药性问题仍是人们长期关注的焦点问题。利福平是当今最主要的抗结核药物之一,如感染菌为利福平耐药,则治疗效果将受到严重影响。因此,利福平耐药性测定尤为重要。然而,由于结核分支杆菌生长缓慢,常规药敏试验需4～6周,不能满足临床之急需。分子生物学技术的不断发展给结核分支杆菌耐药性的快速检测带来了希望。近年的研究表明结核分支杆菌利福平耐药与rPOB基因突变有关。

变形链球菌菌斑生物膜相关基因突变的研究进展

变形链球菌能生成菌斑生物膜,后者与龋病的发生密切相关。随着现代口腔医学和分子生物学的发展,菌斑生物膜相关基因的研究也越来越多,发现了许多与之相关的基因,主要包括与黏附力相关的基因、与群体感应信号系统相关的基因等。对变形链球菌菌斑生物膜相关基因的研究可以更深入地了解其致龋机制,并对寻找防龋新途径作出有益的探索。本文就近年来与变形链球菌菌斑生物膜相关的基因突变研究作一综述。

慢性乙型肝炎HBV前C区基因突变研究(摘要)

目的:观察HBV前C区变异与患者病情轻重及血清e系统的关系,探讨改进的聚合酶链反应一单链构象多态性分析（PCR—SSCP）银染技术用于筛选HBV前C区突变的可行性和效果。方法:用酚—氯仿抽提法提取血清HBV DNA,根据adr亚型HBV基因核苷酸序列,选择Pre-C起始密码上游及C区保守序列设计引物P1、P2进行聚合酶链反应（PCR）,使全前C基因区段（876p）增幅。