抑制SHP2和FGFR2调控RAS/ERK及PI3K/AKT通路治疗FGFR2融合胃癌

目的:探究共抑制成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)和Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)在FGFR2融合胃癌中的应用前景与作用机制。方法:构建过表达TACC2-FGFR2融合基因与对照慢病毒载体的人胃癌细胞系MKN45ACC2T-FGFR2、MKN45NC、NUGC4TACC2-FGFR2、NUGC4NC,分别用FGFR2抑制剂AZD4547、SHP2抑制剂SHP099或联药进行处理,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验检测肿瘤细胞的增殖、迁移能力。以不同处理方式作用于MKN45TACC2-FGFR2、MKN45NC1 h或48 h后,采用Western blot法检测FGFR2、SHP2以及下游RAS/ERK、PI3K/AKT信号通路变化。结果:在MKN45TACC2-FGFR2与NUGC4TACC2-FGFR2中联用AZD4547与SHP099可以比单药更显著地抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。药物处理1 h后,相较于AZD4547单药,联药在MKN45TACC2-FGFR2中进一步抑制了RAS/ERK、PI3K/AKT信号通路。药物处理48 h与1 h相比,AZD4547单药组中磷酸化FGFR与磷酸化SHP2出现了反馈性激活,且始终不能抑制RAS/ERK通路,但联药组可以持续地抑制上游的FGFR2、SHP2信号以及下游的RAS/ERK、PI3K/AKT通路。结论:共抑制FGFR2和SHP2可以通过下调RAS/ERK及PI3K/AKT通路有效抑制FGFR2融合胃癌,为FG-FR2融合突变胃癌患者带来新的治疗模式。

外周血SHP-1、Sestrin2水平与缺血性脑卒中患者颈动脉斑块的相关性分析

目的分析外周血蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)、Sestrin2水平与缺血性脑卒中(CIS)患者颈动脉斑块的相关性。方法选择2018年7月-2021年9月苏州市第九人民医院收治的85例CIS患者为试验组,另选择医院同时间段体检健康人群73例为对照组。分别于入院次日、体检当天检测试验组与对照组血清SHP-1、Sestrin2水平,根据颈动脉斑块是否稳定分为稳定组(59例)与不稳定组(26例),比较对照组与试验组的一般资料,比较稳定组与不稳定组的临床资料,以Logistic回归分析法探讨CIS患者颈动脉斑块不稳定的影响因素,采用Spearman分析血清SHP-1、Sestrin2水平与CIS患者颈动脉斑块不稳定形成的相关性,以受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评估入院时血清Sestrin2、SHP-1水平及二者联合对CIS患者发生颈动脉不稳定斑块的预测价值。结果2组年龄、性别构成、体质量指数(BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05),试验组血清SHP-1水平低于对照组(P<0.05),试验组血清Sestrin2水平高于对照组(P<0.05);不稳定组入院时载脂蛋白A1、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、尿酸、血清Sestrin2水平高于稳定组(P<0.05),不稳定组入院时血清SHP-1水平低于稳定组(P<0.05);Logistic回归分析结果显示,入院时载脂蛋白A1、尿酸、血清SHP-1、Sestrin2水平均为CIS患者颈动脉斑块不稳定的影响因素(P<0.05);Spearman分析结果显示,血清SHP-1水平与CIS患者颈动脉斑块不稳定形成呈负相关(P<0.05),血清Sestrin2水平与CIS患者颈动脉斑块不稳定形成呈正相关(P<0.05);ROC曲线结果显示,入院时血清Sestrin2、SHP-1水平及二者联合预测CIS患者发生颈动脉不稳定斑块的AUC值分别为0.818、0.824、0.868(P<0.05)。结论血清SHP-1水平与CIS患者颈动脉斑块不稳定形成呈负相关,血清Sestrin2水平与CIS患者颈动脉斑块不稳定形成呈正相关,二者可用于预测CIS患者发生颈动脉不稳定斑块,且二者联合预测的价值更高。

SHIP1在胶质瘤中的表达水平及其生物学功能研究

目的研究含有肌醇-5′-磷酸酶1的Src同源物2(Src homology 2-containing inositol-5′-phosphatase 1,SHIP1)在胶质瘤组织中的表达水平及相关临床意义,并研究SHIP1在胶质瘤中发挥的生物学功能。方法qRT-PCR检测SHIP1 mRNA在45例胶质瘤组织和15例正常脑组织中的表达水平,并分析SHIP1 mRNA在胶质瘤组织中的表达水平与患者临床病理参数的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析SHIP1 mRNA表达对患者预后的影响,Cox多因素分析影响胶质瘤患者预后的独立预后危险因素。构建SHIP1过表达质粒,转染胶质瘤细胞系U87,采用MTS实验检测SHIP1对细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测SHIP1对细胞周期的影响,Boyden实验检测SHIP1对细胞侵袭能力。结果qRT-PCR结果显示SHIP1 mRNA在胶质瘤组织中的表达显著低于正常脑组织,其低表达与肿瘤WHO分级相关,SHIP1低表达的胶质瘤患者生存期较短,WHO分级和SHIP1低表达是胶质瘤患者预后不良的独立危险因素。转染SHIP1过表达质粒后,U87细胞增殖和侵袭能力下降,细胞阻滞在G0/G1期。结论SHIP1在胶质瘤组织中低表达,且其低表达与WHO分级及不良预后相关,是患者预后不良的独立危险因素。同时SHIP1抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭能力。SHIP1具有作为胶质瘤患者预后分子标志物及治疗靶点的潜力。

新型SHP2衍生物NC-55-122在大鼠体内的药动学研究及其体内代谢产物分析

考察新型含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP2)蛋白抑制剂三唑并喹啉酮衍生物NC-55-122在大鼠体内的药代动力学特征,并在此基础上对化合物NC-55-122在大鼠体内的代谢产物进行分析。首先将大鼠随机分组,分别灌胃和静脉给予化合物NC-55-122,采集不同时间点的血样,以卡马西平为内标,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定大鼠体内NC-55-122的浓度,并进行方法学的验证,用DAS 2.0软件计算主要的药代动力学参数,采用Graph Pad Prism 8.0.1软件绘制血药浓度-时间曲线;并同时建立超高液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF/MS)对血浆样品进行分析,并运用UNIFI代谢产物预测软件分析经大鼠灌胃和静脉给药后的代谢产物。结果表明,化合物NC-55-122检测质量浓度的线性范围为1~1600 ng·m L^(-1),线性关系良好,在此线性范围内进行基质效应和提取回收率、精密度和准确度以及稳定性的考察,均符合生物分析要求;其次,药动学参数分析表明该化合物的口服生物利用度相对较低,仅为3.09%,但该化合物在体内吸收的速度较慢;最后通过分析离子流图以及结合UNIFI软件共推测出5个可能的代谢产物。本实验建立的检测方法灵敏度高,专属性强、快速、高效,适用于化合物NC-55-122在大鼠体内血药浓度的测定以及代谢产物的分析,为后期抗肿瘤药物NC-55-122的结构修饰以及成药性评价奠定基础。所有动物实验均经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号:2200823)。

胰岛素受体底物和酪氨酸磷酸酶在2型糖尿病大鼠肌肉组织中的蛋白表达及其意义

目的研究2型糖尿病对胰岛素产生抵抗的分子机制。方法用Western杂交检测2型糖尿病模型(OLETF大鼠)肌肉组织内IRS-1及SH-PTP2的蛋白表达水平,并以同种属的Wistar大鼠做比较。结果OLETF糖尿病大鼠的空腹和餐后血糖水平较对照组明显增高(P<0.05);Western杂交显示OLETF大鼠肌肉组织内IRS-1蛋白表达较对照组减少(P<0.05);而SH-PTP2的蛋白表达则较对照组增加(P<0.05)。结论IRS-1及SH-PTP2蛋白表达的异常改变,可能是引起2型糖尿病产生胰岛素抵抗的分子机制之一。

炎症环境下敲低SHP2对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨炎症环境下含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖及成骨分化的调节作用和相关机制,为牙周炎治疗提供新的靶点。方法使用慢病毒感染构建敲低SHP2基因的hPDLSCs细胞系,通过RT-qPCR、Western blot验证SHP2的敲低水平;使用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在体外模拟炎症环境;CCK-8检测正常及炎症条件下敲低SHP2对hPDLSCs增殖的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、ALP活性检测、ARS染色、RT-qPCR以及Western blot检测成骨指标;Western blot检测敲低SHP2在炎症条件下,对丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB(mitogen-activated protein kinase/nuclear factor-κB,MAPK/NF-κB)通路蛋白的影响。结果慢病毒感染细胞72 h后在荧光显微镜下显示出明显的绿色荧光,测得SHP2 shRNA重组慢病毒的滴度为2.9×10^(8) TU/mL;Western blot及RT-qPCR检测发现,SHP2敲低组的SHP2蛋白及基因的表达显著降低(P<0.001);在正常条件下,敲低SHP2在一定程度上抑制了hPDLSCs的增殖;敲低SHP2后,hPDLSCs的早期成骨指标增高,包括ALP活性显著增高,ALP和COL-1的表达增加(P<0.05),然而敲低SHP2对hPDLSCs最终产生钙结节的量无明显影响。在TNF-α和IL-1β诱导的炎症环境下,敲低SHP2对hPDLSCs的增殖无明显影响(P>0.05),敲低SHP2后,hPDLSCs成骨相关指标均增加(P<0.05),钙结节形成的量增多(P<0.05);炎症环境下,敲低SHP2后,hPDLSCs中p65的磷酸化和IκB-α的降解降低,并且NF-κB上游MAPK通路蛋白p-p38和p-JNK的表达降低(P<0.05)。结论炎症环境下,敲低SHP2对hPDLSCs的增殖无明显影响,但可通过抑制MAPK/NFκB通路促进hPDLSCs成骨分化。

Ⅱ型糖尿病病人脂肪组织胰岛素受体底物1和含2个SH_2结构的蛋白酪氨酸磷酸酶的蛋白表达

目的 研究Ⅱ型糖尿病患者脂肪组织胰岛素受体底物 1(IRS 1)及含 2个SH2 结构的蛋白酪氨酸磷酸酶 (SH PTP2 )蛋白表达 ,探讨脂肪组织产生胰岛素抵抗的分子机制。方法 用Western杂交检测Ⅱ型糖尿病患者腹部皮下与大网膜脂肪组织IRS 1、SH PTP2 的蛋白表达 ;同时比较患者自身皮下与大网膜内蛋白表达水平。结果 IRS 1蛋白表达 (A值 )在糖尿病患者皮下脂肪 (2 14± 0 6 7)、大网膜内 (3 2 5± 0 70 )均较对照组 [4 33± 0 5 7(P <0 0 0 1)、8 6 5± 2 85 (P <0 0 5 ) ]减少 ;而SH PTP2与对照组比较差异无显著性 (P >0 0 5 )。IRS 1蛋白表达在患者自身皮下脂肪 (1 0 9± 0 13)较大网膜(2 10± 0 2 2 )减少 (P <0 0 5 ) ;而SH PTP2 在皮下 (70 75± 2 18)则较大网膜 (4 3 6 9± 11 0 7)增加 (P <0 0 5 )。结论 Ⅱ型糖尿病患者脂肪组织IRS 1及SH PTP2 蛋白表达的异常改变可能是引起其产生胰岛素抵抗的机制之一 ;Ⅱ型糖尿病患者的腹部皮下脂肪和内脏脂肪一样存在胰岛素抵抗。

血脂变化对OLETF大鼠肝脏、脂肪组织胰岛素受体底物1和含2个SH结构的蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白表达的影响

目的观察血脂变化对OLETF大鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)和含2个SH结构的蛋白酪氨酸磷酸酶(SH-PTP2)蛋白表达的影响。方法 14只OLETF大鼠被随机分为降脂治疗组和对照组。采用Western杂交技术检测OLETF大鼠肝脏、脂肪组织内IRS-1及SH-PTP2的蛋白表达水平。结果降脂治疗组血糖及血脂水平较对照组下降(P<0.05),肝脏、脂肪组织内IRS-1蛋白表达较对照组增加(t=14.61,15.76,P均<0.01),而SH-PTP2的蛋白表达较对照组减少(t=-3.07、-28.76,P均<0.01)。结论降脂治疗可增加OLETF大鼠肝脏、脂肪组织内IRS-1蛋白表达,减少其SH-PTP2蛋白表达,并可能因此影响其胰岛素信号传导,改善其靶组织对胰岛素的敏感性。

5-苯基-1,3,4-噻二唑衍生物的合成及含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)抑制活性研究

作为细胞信号转导通路的关键节点分子,含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)是潜在的抗肿瘤靶点.已知的SHP1抑制剂屈指可数.设计并合成了11个5-苯基-1,3,4-噻二唑衍生物.活性测试结果表明,部分衍生物对SHP1显示了一定强度的抑制活性.其中,化合物5b[IC50=(1.33±0.16)μmol/L]对SHP1显示了中等强度的抑制活性,对PTP1B和TCPTP不显示抑制活性,对SHP2显示了2倍的选择性,为发现新型SHP1抑制剂提供了新的骨架类型.

他莫昔芬对Luminal A型乳腺癌大鼠的影响研究

目的研究他莫昔芬对Luminal A型乳腺癌大鼠Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)表达水平的影响。方法选取健康雌性未孕SD大鼠80只,其中62只用7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)灌胃建立Luminal A型乳腺癌模型,空白组18只用等量食用花生油灌胃。将造模成功的54只大鼠随机分为模型组、对照组和实验组,各18只。实验组给予0. 6 mg·m L^(-1)枸橼酸他莫昔芬溶液1 m L,灌胃,每天1次;对照组给予0. 15 mg·m L^(-1)来曲唑溶液1 m L,灌胃,每天1次;模型组及空白组分别给予蒸馏水1 m L,灌胃,每天1次;各组均连续给药3周。观察各组大鼠的肿瘤体积、瘤重及抑瘤率、血清性激素水平、肿瘤组织SHP-1 mRNA及SHP-1蛋白、细胞外调节蛋白激酶1/2(p-Erk1/2)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)蛋白表达水平进行检测。结果治疗后,模型组、实验组和对照组肿瘤体积分别为(5. 01±0. 58),(1. 15±0. 09)和(1. 53±0. 18) cm^3,瘤重分别为(5. 83±0. 67),(1. 84±0. 25)和(2. 49±0. 31) g,实验组和对照组抑瘤率分别为68. 44%和57. 29%,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。空白组、模型组、实验组和对照组肿瘤组织SHP-1 mRNA分别为2. 58±0. 36,0. 72±0. 09,1. 91±0. 27和1. 42±0. 18,SHP-1蛋白分别为2. 16±0. 27,0. 62±0. 08,1. 73±0. 24和1. 35±0. 15,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论他莫昔芬能有效抑制Luminal A型乳腺癌大鼠肿瘤生长,其作用可能与上调SHP-1基因及其相关蛋白表达有关。