葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1/SLC7A11抑制铁死亡对骨肉瘤发生发展的影响

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)对骨肉瘤细胞生物学功能的影响,及其通过SLC7A11调控骨肉瘤细胞铁死亡的作用机制。方法检测人成骨细胞hFOB1.19以及骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1的表达水平。采用小干扰RNA敲减骨肉瘤细胞HOS和143B中SND1的表达(si-SND1),采用CCK8法、细胞克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验探究SND1的表达对骨肉瘤细胞生物学功能的影响;调控骨肉瘤细胞中SND1以及SLC7A11基因的表达,探究SND1通过SLC7A1基因对骨肉瘤铁死亡介导的肿瘤细胞凋亡的影响。结果骨肉瘤细胞Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于人成骨细胞hFOB1.19(P均<0.01)。与对照组比较,si-SND1转染显著降低HOS和143B细胞中SND1的表达水平(P均<0.01),且细胞活性显著降低,克隆形成数量显著减少,细胞迁移和侵袭能力显著降低(P均<0.001)。铁死亡诱导剂Erastin促进骨肉瘤HOS和143B细胞凋亡,而抑制剂Ferrostatin-1刺激上调细胞活性(P均<0.001)。敲减SND-1后使用Erastin可进一步降低骨肉瘤HOS和143B细胞活性,而使用Ferrostatin-1刺激后可显著恢复细胞活性(P均<0.001);Erastin处理后,si-SND1组细胞中铁离子和丙二醛表达增高,谷胱甘肽表达降低(P均<0.001)。体内实验结果显示,敲减SND1可以明显抑制143B裸鼠移植瘤的瘤体质量(P<0.001)。敲减SND1后骨肉瘤HOS和143B细胞中SLC7A11的表达水平显著减少(P均<0.001),且铁死亡水平升高(P<0.001,P=0.020)。结论骨肉瘤细胞中SND1表达显著增高,其可能通过上调SLC7A11的表达抑制铁死亡,进而促进骨肉瘤细胞活性。

SND1通过识别TINCR的甲基化位点促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长

目的探讨葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1(SND1)与组织分化诱导非编码RNA(TINCR)的相互作用及其对TINCR表达水平和瘢痕疙瘩生长的影响。方法收集2016年6月-2018年5月在陕西省人民医院接受治疗的Ⅱ、Ⅲ度烧伤患者的瘢痕疙瘩组织样本(n=27)。运用生物信息学方法预测TINCR序列中的RNA甲基化位点;培养人原代正常皮肤成纤维细胞(HFs)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs),设置HFs组和KFs组。取对数生长期KFs,设置:(1)对照组、空载组及甲基转移酶样蛋白3(METTL3)过表达组;(2)对照组和3-脱氮基腺苷(DAA)组;(3)对照组、SND1重组蛋白组及SND1重组蛋白+DAA组。采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测HFs和KFs中TINCR的相对表达水平,甲基化RNA免疫沉淀技术(MeRIP)联合RT-qPCR检测TINCR的甲基化水平,Western blotting检测SND1和METTL3蛋白的相对表达水平,放线菌素D处理联合RT-qPCR检测TINCR残留水平,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力。取18只BALB/c裸鼠,构建瘢痕疙瘩异种移植模型,随机分为瘢痕疙瘩组、瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白组及瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白+DAA组,每组6只,采用HE染色观察瘢痕疙瘩组织生长情况,免疫组化染色和Western blotting检测SND1在瘢痕疙瘩组织中的表达水平。结果TINCR第三外显子含有7个潜在的RNA甲基化位点。与HFs相比,KFs中TINCR相对表达水平(5.43±0.35 vs.1.00±0.11,P<0.01)和甲基化水平(19.73%±1.56%vs.10.25%±1.13%,P<0.01)均明显升高,SND1和METTL3蛋白相对表达水平明显增高(P<0.01),甲基化的TINCR与SND1和METTL3均有结合。与空载组相比,METTL3过表达可促进METTL3 mRNA和蛋白的表达(mRNA:6.03±0.55 vs.1.09±0.09,P<0.01;蛋白:4.33±0.35 vs.0.96±0.08,P<0.01)、增高TINCR甲基化水平(32.89%±2.88%vs.19.04%±1.72%,P<0.01)和相对表达水平(4.65±0.32 vs.1.00±0.10,P<0.01)。与对照组相比,DAA处理可降低TINCR的稳定性[(8.50±1.13)h vs.(12.90±1.41)h,P<0.001]和甲基化水平(7.43%±0.55%vs.18.88%±1.76%,P<0.01),抑制KFs的活力和克隆形成能力(P<0.01)。与对照组相比,SND1重组蛋白处理可增加TINCR的稳定性[(23.95±1.25)h vs.(13.10±1.33)h,P<0.01]、细胞活力和克隆形成能力(P<0.01),但对TINCR甲基化水平(20.15%±1.74%vs.19.04%±1.77%,P>0.05)无明显影响;DAA处理可消除SND1重组蛋白对TINCR稳定性[(12.00±1.21)h vs.(23.95±1.44)h,P<0.01]、细胞活力和克隆形成能力的影响(P<0.01)。与瘢痕疙瘩组相比,瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白组真皮层有大量成纤维细胞和胶原纤维,瘢痕疙瘩组织中SND1阳性细胞百分比(63.43%±3.32%vs.21.16%±4.67%,P<0.01)和蛋白相对表达水平(2.54±0.13 vs.1.00±0.10,P<0.01)明显增高;而经DAA处理后,瘢痕疙瘩组织中有大量疏松的胶原纤维,SND1阳性细胞百分比(38.52%±6.88%vs.63.43%±3.32%,P<0.01)和蛋白表达水平(1.07±0.09 vs.2.54±0.13,P<0.01)明显降低。结论KFs中TINCR呈高甲基化水平,SND1可识别并结合TINCR的甲基化位点,增强TINCR的稳定性,促进TINCR介导的瘢痕疙瘩生长。

葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1在应激刺激下与T细胞胞内抗原1共同参与应激颗粒聚集

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)在应激刺激下如何与T细胞胞内抗原1(TIA-1)共同参与应激颗粒(SG)的聚集以及如何调节应激反应。方法利用免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞中的SND1蛋白与TIA-1蛋白在应激刺激下是否形成共定位颗粒,并利用绿色荧光蛋白载体过表达质粒转染HeLa细胞进行外源蛋白表达,从而确定在应激刺激下SND1蛋白与TIA-1结合的结构域。利用RNA干扰技术敲除HeLa细胞中SND1蛋白表达并利用Western Blotting检测蛋白表达水平,从而观察SND1低表达是否对TIA-1聚集形成SG产生影响。利用不同热休克刺激时间观察SND1与TIA-1的聚集过程是否存在动态变化。结果 SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白结合共同参与SG聚集,其主要作用结构域为葡萄球菌核酸酶结构域(SN domain)。SND1低表达不会抑制TIA-1聚集到SG,但会减少SG的数量。在不同热休克刺激时间下,SND1聚集到SG的运输过程滞后于TIA-1。结论 SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白共同参与SG的聚集,从而调节细胞应激反应。

SND1蛋白与HuR蛋白相互结合作用

人源SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白由N端的SN（staphylococcal nucleases）结构域和C端的TSN（Tudor-SN5）结构域组成,其中SN结构域又包含SN1~SN4四个重复的功能片段.本课题组前期研究结果表明,SND1蛋白可以通过SN结构域与G3BP（Ras-GAP SH3 domain-binding protein）蛋白相互结合,共同参与细胞应激颗粒（stress granules,SGs）的形成.SGs是真核细胞在受到氧化应激、病毒感染等外界刺激时在胞浆内形成的与RNA代谢相关的颗粒状结构.对于SGs的成分鉴定及相互作用的分析一直是学者们研究的热点.本研究中,免疫共沉淀实验结果表明,以抗SND1抗体可以共沉淀出HeLa细胞内另一个重要的应激相关人类抗原R（human antigen R,HuR）蛋白.另外,利用脂质体转染法将pcDNA3-FLAG-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,成功过表达外源性的FLAG-HuR融合蛋白,再以抗FLAG标签抗体又可以反向共沉淀出内源性SND1蛋白,证明SND1与HuR之间存在蛋白质间的相互结合作用.细胞免疫荧光实验结果表明,当给予HeLa细胞0.5 mmol/L亚砷酸钠氧化应激时,SND1与HuR蛋白共同定位于胞浆中的SGs结构中.GST-pulldown实验结果进一步表明截短的SN结构域可以结合HuR蛋白,其中以SN1功能片段的结合能力最强,表明SND1蛋白是通过SN结构域与HuR蛋白形成应激复合物,参与SGs的胞浆组装.并不定位于SGs的TSN结构域亦可结合HuR蛋白,提示SND1-HuR的蛋白相互作用可能并不局限于SGs,具有其它方面的功能意义.

卵巢癌细胞系OVCAR3过表达SND1稳定株的构建

目的:通过慢病毒载体构建过表达SND1的OVCAR3稳定的表达株。方法:重组的pLVX-FLAG-SND1表达载体与包装质粒共同转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒。病毒感染的OVCAR3细胞经Hygromycin B筛选出稳定表达株。用Western blot方法检测SND1蛋白表达。结果:用病毒感染OVCAR3细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中SND1蛋白表达水平明显增高。结论:利用慢病毒表达载体pLVX-FLAG-SND1成功感染并筛选出稳定表达SND1的OVCAR3细胞株,为进一步研究SND1在卵巢癌中的作用提供了体外细胞系模型。

沉默SND1重组慢病毒制备及其对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨沉默葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1(Staphylococcal nuclease domain containing 1,SND1)表达对乳腺癌细胞系MCF-7增殖和侵袭迁移的影响。方法:制备可介导SND1靶向沉默的重组慢病毒,感染MCF-7细胞建立沉默SND1的稳定亚细胞系;用qRT-PCR和Western blot检测SND1沉默效果;用噻唑蓝(MTS)染色法、细胞划痕和transwell实验,检测沉默SND1后MCF-7细胞增殖及侵袭迁移能力的变化。结果:成功构建了表达靶向SND1shRNA及对照shRNA的重组慢病毒质粒,经包装获得重组慢病毒(LV-SH1、LV-SH2、LV-SH3和LV-NC);用上述慢病毒感染MCF-7细胞,筛选出SND1沉默效果最佳的稳定亚细胞系MCF-SH3;增殖与侵袭迁移检测结果显示,MCF-SH3的增殖活性及侵袭迁移能力显著低于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:SND1可以促进乳腺癌细胞增殖及侵袭迁移,沉默SND1表达可抑制其增殖及侵袭迁移,提示SND1表达异常与乳腺癌密切相关,可能通过影响细胞增殖及侵袭迁移在乳腺癌的发生发展中起重要作用。

基因前定点敲入FLAG标签表达的FLAG-SND1蛋白参与胞内应激颗粒的形成

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术是近年来新兴的一种可以实现基因特异性敲除和敲入的技术。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将3×FLAG标签定点敲入HeLa细胞SND1基因前方,使细胞内源性表达的SND1蛋白带有3×FLAG标签,并观察SND1与应激颗粒及加工体的定位情况。设计针对SND1基因起始密码子ATG附近的sgRNA,以px459为表达载体,构建出重组真核表达质粒。设计含有3×FLAG及待插入位置上下游150 bp同源臂的序列,经公司合成获得重组质粒。将2个质粒共同转染HeLa细胞,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞,挑取单克隆后培养。Western印迹表明,细胞表达3×FLAGSND1融合蛋白质。提取细胞基因组DNA进行测序。测序无误获得稳定株后,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,发现与WT细胞相比无显著性差异。同时,使用05 mmol/L亚砷酸钠处理,细胞发生氧化应激,eIF2α蛋白磷酸化增加,胞浆中出现应激颗粒,SND1与应激颗粒标志蛋白TIAR存在共定位现象,但不存在与加工体蛋白DCP1α的共定位。