22R序列loop和泡突变对GFP报告基因表达的作用

目的:我们研究室的前期工作在猴空泡病毒40(SV40)早期mRNA PolyA序列(SV40PolyA)中发现1个活化基因的原件22R(5′-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT-3′),该片段可以解除Alu串连序列(或Line-1重复序列)对GFP报告基因的抑制作用。我们研究22R突变对GFP报告基因表达的作用。方法:将22R及其突变片段插入pEGFP-C1质粒,构建表达载体,瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数。结果:AAG、AGA、TGT、TTG和TGC(22R,野生型)5个质粒促进基因表达作用比较明显。VECT、VEGT、VETA、VETC、VETG和VETT明显促进GFP基因表达。结论:22Rloop和泡的突变对其活化GFP报告基因作用有重要影响。

cGAS蛋白促进PCV-2茎环结构诱导cGAS-STING信号通路天然免疫反应研究

为了探索猪圆环病毒2型(PCV-2)DNA茎环结构是否可以激活环鸟苷酸腺苷酸合成酶(cGAS),以及是否诱导cGAS-STING信号通路天然免疫反应,试验将含有PCV-2茎环结构的单链DNA(SL-DNA)转染至PK15细胞中,通过Western-blot检测cGAS蛋白是否在PK15细胞中表达;将SL-DNA转染至过表达及敲除cGAS蛋白的PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR检测细胞中cGAS、干扰素刺激基因(STING)、TANK结合激酶1(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素-β(IFN-β)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的表达水平。结果表明:SL-DNA转染后,PK15细胞中cGAS蛋白表达量上升;过表达cGAS蛋白的PK15细胞与PK15细胞相比,SL-DNA转染后cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α基因的相对表达量均极显著升高(P<0.01);敲除cGAS蛋白的PK15细胞与PK15细胞相比,SL-DNA转染后cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。说明cGAS蛋白可以识别PCV-2的茎环结构,并且促进其诱导的cGAS-STING信号通路天然免疫反应。

RNA二级结构预测SVMs模型研究

扩展NSSEL标签,对RNA分子中的stem-loop结构和伪结结构进行标记.将RNA分子序列中的碱基编码输入,经过支持向量机(support vector machines,SVMs)模型计算输出相应的结构标记.该模型经过训练后,待预测的RNA分子序列可得到对应的结构标识序列,这些标识序列可通过特定算法,唯一构建包括伪结在内的二级结构.实验结果表明,该算法在可接受的预测精度范围内具有较低的计算复杂度,克服了传统算法计算时间过长,无法在有限时间内得到有效结果的缺点.

茎环结构DNA循环放大技术测定水样中的痕量银离子

利用茎环结构DNA的循环杂交放大作用和碱基C与Ag^+之间的稳定结构,设计了一种高灵敏性的表面增强拉曼生物传感器用于水样中Ag^+的检测。首先制备了携带有大量拉曼信号分子的纳米金生物条码作为拉曼信号探针。然后通过酰胺键将捕获DNA固载在磁珠表面上,利用C-Ag^+-C形成的稳定结构和链式循环杂交反应放大技术,将含有大量拉曼信号DNA分子的纳米金颗粒通过生物素和链霉亲和素的特异性结合到磁珠上,最后通过SERS技术实现了溶液中Ag^+的检测。最佳实验条件下,当固定磁珠捕获DNA浓度为1.0×10^(-7)M,Tris-HCl缓冲溶液为pH7.4,37℃下杂交反应2.5 h后,Ag^+的浓度与拉曼信号强度呈良好的线性关系,测定线性范围为1.0×10^(-7)~1.0×10^(-12)M,检测限1.0×10^(-12)M(S/N=3)。该传感器用于海产品中Ag^+的测定,测定值与ICP-AES的测定值基本一致。

单股正链RNA病毒基因组3'非编码区功能

单股正链RNA病毒数量众多,对人、动物和植物造成很大的危害。病毒基因组3'末端都具有一段非编码区,基因组3'非编码区在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。本文简单介绍了单股正链RNA病毒基因组3'非编码区结构的预测、测定和功能的研究方法,并重点概括了不同单股正链RNA病毒3'非编码区一级序列、茎-环结构、假结体、TLS等结构在病毒基因组的复制、转录和翻译中的调控作用以及目前存在的问题。

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因表达调控序列的初步解析

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是世界养猪业的一个巨大的威胁。近年来,此病给各国养猪业造成了巨大的经济损失。本文立足于反向遗传操作技术,介绍了调控PRRS病毒粒子的感染性、基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录以及翻译等重要过程的顺式调控元件的一级序列和高级结构的最新研究进展。

小米psbA基因5'末端非编码区的结构特征

以小米(Setaria italica)为材料,克隆了含有叶绿体psbA基因的2.2kb EcoRⅠ片段,测定了该基因5＇末端非编码区的核苷酸序列。序列分析显示psbA基因5＇末端非编码区存在着与原核类似的启动子结构,其“-10”区的序列为TATACT,与原核生物“-10”共有基序(Consensus motif)仅相差一个核苷酸;其“-35”区的序列为TTGACA,与原核生物“-35”共有基序完全相同。另外,在“-10”区和“-35”区之间还存在着一个类似真核启动子结构的“TATATA”保守序列。这些结果表明小米psbA基因的启动子既具有原核的特征又具有真核的特征。小米psbA基因的mRNA前导序列长87bp,与高粱完全一致,而比水稻多出了“CTATTTT”7个核苷酸,比小麦、大麦和黑麦多出了“TTTT”4个核苷酸。因此推测在禾本科的C_3和C_4植物之间,psbA基因mRNA前导序列区的差异可能具有普遍性。计算机分析结果显示,以上6种植物的psbA基因mRNA前导序列区内均能形成小的茎环结构,而且这段“CTATTTT”额外序列恰好位于茎环结构中,造成了6种植物间茎环大小的差异。这一小的二级结构可能对psbA基因的表达调控有一定的影响。

灵长类等TATA框折叠结构特征比较

通过对灵长类 ,啮齿类 ,无脊椎类三个物种各 40个基因部分启动子系列的折叠结构进行分析研究 ,结果表明 :不同物种基因的TATA框在折叠结构模型中所表现的茎环结构特征的分布频率存在明显差异 .

用定点突变技术研究转录终止——rpoBC操纵子上~tL7茎环结构的作用研究

E.coli RNA聚合酶ββ'亚单位编码的基因rpoBC与核糖核蛋白基因rplJL共同构成rpoBC操纵子。rpl-rpo间区转录终止信号~tL7的转录产物RNA有两组富含C-G的反向对称结构及一串寡聚U;反向对称区可形成1:2和3:4茎环或单一5:6茎环。 用M13mp11噬菌体插入~tL7的112bp片段重组M13mp11-490,在此基础上用定点突变技术建立~tL7的七核苷酸缺失突变体,从而破坏1:2茎环,建成M13mp11-85。 分别把原型~tL7及缺失型~tL7~v克隆到表达质粒pHR24中,构建成pHR37(P_ftsQ^tL7-galk)及pHR24-9(p_ftsQ-~tL7~v-galk)。测定galk基因产物半乳糖激酶活性,推算转录的终止效率。结果表明:~tL7终止效率为50％,~tL7~v为20％。说明仅有3:4茎环及寡聚U,即具终止作用; 1:2茎环通过某种方式加强3:4茎环从而提高终止效率。

MiRdetector:一个预测与搜寻miRNA基因的计算工具

MicroRNA（miRNA）是一类内源性的长约21～24nucleotide（nt）的非编码小分子RNA，能够调节其它基因的表达活性，在生物体的发育过程中发挥重要的作用．每种生物体中miRNA的基因总数还未知，生物信息学分析手段为发现新的miRNA基因提供了有效的方法．作者开发了一个预测与搜寻miRNA基因的完全自动化系统“MiRdetector”．MiRdetector系统是基于计算机比对和miRNA前体茎环结构判断的．用水稻miRNA基因对系统的预测精度进行了检验。系统正确识别了155个样本中的140个，预测精度达到90．32％，并且搜寻到了95个可能的水稻miRNA基因。由于系统的假阳性率较低，因此能够为进一步证实miRNA基因的实验研究提供高质量的数据集．

用序列比对设计的茎环结构探针检测金黄色葡萄球菌

基于金黄色葡萄球菌16S rRNA基因序列,采用序列比对设计了一种茎环结构的寡聚核苷酸探针。探针的环序列即为金黄色葡萄球菌16S rRNA基因序列的其中一个片段,同其他菌种的16S rRNA基因序列误配2个以上的核苷酸,因此能高度专一、灵敏的检测金黄色葡萄球菌16S rRNA。根据分子信标技术和酶联免疫分析的原理,评估一个实验方法,即利用能构象转换的、固定化的茎环结构探针酶联检测靶核酸。由于探针的特异性加强,这个检测系统能有效的排除假阳性即不会出现误配一个核苷酸的情况。采用微量浓度测定分析,最低下限可检测出大约4ng的金葡球菌16SrRNA。这种方法的灵敏度比其他常规检测方法高出了至少一个数量级。

小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面。多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达。这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和U6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP。通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中。由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有鮈鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测。研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达。研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑。

以茎环结构为模板的DNA银纳米簇合成及其检测方法应用

以DNA为模板合成的银纳米簇是一类优异的荧光物质,它可以在DNA模板上通过简单的步骤原位合成。由于其尺寸小,量子产率高,发射波长可调以及较低的毒性,很好的生物相容性而受到广泛的关注和研究。DNA银纳米簇的性质在很大程度上取决于DNA模板。茎环结构(发夹结构)DNA是单链DNA的一种特殊的二级结构,其由双链茎部及单链的环部组成,其双链部分使发夹结构具有一定的刚性,能更好的稳定银纳米簇,同时其单链环部可以作为银纳米簇很好的合成支架。本文立足于茎环结构DNA模板化的银纳米簇,总结了该银纳米簇的合成及其检测应用的研究进展,将会为预测并设计具有优异荧光性质的DNA银纳米簇提供理论基础,有望进一步拓展DNA银纳米簇在检测上的应用。

bta-miR-377琼脂糖凝胶电泳条件优化

bta-miR-377与下丘脑分泌的可卡因苯丙胺调节转录肽(Cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)存在靶向结合关系。为分析bta-miR-377在牛下丘脑组织中的表达情况,为后续探讨bta-miR-377与CART相互作用进而影响牛卵泡发育的作用机制奠定基础,经Trizol法提取牛下丘脑总RNA,采用茎环结构法设计特异性引物,并利用半定量RT-PCR技术克隆bta-miR-377,观察不同条件琼脂糖凝胶电泳后Marker和目的条带的分离情况,其中凝胶浓度为2.0%、2.5%;电压为100、80 V;时间为40、60、80 min;同时通过Image J软件对不同条件下获得的bta-miR-377条带进行灰度值分析,结合电泳结果确定最佳分离条件。结果显示,利用茎环结构法能够达到延长bta-miR-377片段的目的,且特异性强;凝胶浓度为2.5%、电压为80 V、时间为80 min时,bta-miR-377条带分离效果好且表达量高,该条件下条带的灰度值与其他组相比差异显著,与电泳分析结果一致,说明低浓度凝胶的分辨率低,长时间高压会导致DNA降解进而使条带弥散,而适当电压下电泳时间过短会使DNA分子无法聚集而使条带过宽,说明适宜的电泳条件是鉴定目的 miRNA表达的关键。综上可见,bta-miR-377在牛下丘脑中有表达,丰富了动物生殖生理学中下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌调控理论。

基于具有多茎环特征GA-SVM的人类Pre-miRNA的预测研究

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21 nt的非编码RNA,在动植物中发挥着重要而广泛的转录后调控作用.现有的计算预测方法通常不能很好地识别具有多分枝茎环二级结构的pre-miRNA.为进一步提高对pre-miRNA的预测精度,本文在以往研究的基础上,新引用了一类多茎环生物学特征,将遗传算法(GA)与支持向量机(SVM)结合以进行特征选择,同时优化SVM分类器模型参数(c,g),并对数据集的不平衡性进行处理,构造出新的分类器.本文采用人类pre-miRNA作为研究数据集,通过5折交叉验证,实验结果显示,新的分类器能够有效地提高预测精度.

基于PET原理的FAM标记核酸适配体的汞离子检测研究

汞作为毒性最大的重金属之一,在环境中难以降解。利用光致诱导电子转移(PET)原理设计单端荧光标记核酸适配体用于汞离子检测研究。采用分子荧光光谱进行表征,激发波长490 nm,发射光谱范围为516~650 nm。在适配体5′末端修饰鸟嘌呤(G)碱基作为荧光淬灭基团,在3′末端修饰荧光素(FAM)基团。加入汞离子后,无规则卷曲单链形成茎环结构双链,G碱基与FAM接近产生PET效应荧光淬灭。在此体系中,线性范围为0~9 nmol/L,检测限为0.15 nmol/L,可在自来水中检测Hg^2+,回收率82.5%~98%。具有较高的灵敏度和特异性,操作方法简单。

与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。

转录后调控元件部分或完全缺失对乙型肝炎病毒前基因组RNA核外输出的影响

目的探讨转录后调控元件(post-transcriptional regulatory element,PRE)部分或完全缺失对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)核外输出的影响。方法以含HBV全基因组质粒为模板,采用PCR法构建PRE完全缺失质粒(HBVΔPRE)、PREα缺失质粒(HBVΔPREα)、PREβ缺失质粒(HBVΔPREβ)、SLα缺失质粒(HBVΔSLα)、SLβ缺失质粒(HBVΔSLβ)。对数生长期人肝癌HepG2细胞分为WT组(转染HBV全基因组质粒)、del-PREα组(转染HBVΔPREα)、del-PREβ组(转染HBVΔPREβ)、del-PRE组(转染HBVΔPRE),转染48h后采用反转录实时荧光定量PCR法检测4组细胞、细胞质、细胞核HBV pgRNA相对表达量,计算细胞质与细胞核HBV pgRNA比值(细胞质/细胞核HBV pgRNA);采用Western blot法检测WT组与del-PRE组细胞乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)蛋白相对表达量。对数生长期HepG2细胞分为WT组(转染HBV全基因组质粒)、del-SLα组(转染HBVΔSLα)、del-SLβ组(转染HBVΔSLβ),转染48h后采用反转录实时荧光定量PCR法检测3组细胞、细胞质、细胞核HBV pgRNA相对表达量,计算细胞质/细胞核HBV pgRNA。结果WT组细胞、细胞质HBV pgRNA相对表达量(1.03±0.07、1.01±0.21)及细胞质/细胞核HBV pgRNA(1.01±0.01)均高于del-PREα组(0.74±0.04、0.57±0.01、0.41±0.00)、del-PREβ组(0.58±0.02、0.24±0.01、0.30±0.01)、del-PRE组(0.41±0.01、0.21±0.00、0.30±0.00)(P<0.05),del-PREα组均高于del-PREβ组、del-PRE组(P<0.05);del-PREβ组细胞、细胞质HBV pgRNA相对表达量均高于del-PRE组(P<0.05),细胞质/细胞核HBV pgRNA与del-PRE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。del-PREα组细胞核HBV pgRNA相对表达量(1.38±0.01)均高于WT组(1.00±0.02)、del-PREβ组(0.79±0.01)、del-PRE组(0.71±0.01)(P<0.05),WT组均高于del-PREβ组、del-PRE组(P<0.05),del-PREβ组高于del-PRE组(P<0.05)。del-PRE组HBsAg蛋白相对表达量(0.66±0.00)低于WT组(1.01±0.01)(t=70.136,P<0.001),HBcAg蛋白相对表达量(1.25±0.06)高于WT组(1.00±0.06)(t=—6.378,P=0.023)。del-SLα组细胞、细胞核HBV pgRNA相对表达量(1.47±0.01、1.84±0.02)均高于WT组(1.04±0.07、1.01±0.02)、del-SLβ组(0.74±0.01、0.87±0.03)(P<0.05),WT组均高于del-SLβ组(P<0.05);WT组细胞质HBV pgRNA相对表达量(1.01±0.02)、细胞质/细胞核HBV pgRNA(1.00±0.01)均高于del-SLα组(0.95±0.00、0.52±0.01)、del-SLβ组(0.76±0.01、0.87±0.03)(P<0.05),del-SLα组细胞质HBV pgRNA相对表达量高于del-SLβ组(P<0.05),细胞质/细胞核HBV pgRNA低于del-SLβ组(P<0.05)。结论HepG2细胞PRE部分或完全缺失可抑制HBV pgRNA合成及核外输出,茎环结构SLα、SLβ缺失突变可抑制HBV pgRNA核外输出。