靶向MMP-9的siRNA抑制人类SGC7901胃腺癌细胞侵袭和迁移的研究

目的:探讨基质金属蛋白酶(MMP-9)siRNA对胃腺癌细胞系SGC7901中MMP-9表达的影响以及siRNA干扰后对SGC7901细胞侵袭和迁移的抑制作用。方法:设计合成针对MMP-9的siRNA,采用oligofectamine转染SGC7901胃腺癌细胞,分别采用实时定量聚合酶链反应(realtime PCR)和蛋白印迹法分别检测转染细胞后MMP-9mRNA及蛋白的表达。Matrgel 3D生长实验和Transwell实验检测细胞侵袭情况,Matrgel2D生长实验和划痕实验检测细胞迁移情况。结果:realtime PCR和蛋白印迹法显示转染MMP-9 siRNA后细胞中MMP-9mRNA和蛋白的表达较空白组和对照组明显降低。RNA干扰MMP-9基因后SGC7901细胞的侵袭和迁移能力也有明显下降。结论:靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性的降低MMP-9mRNA及蛋白的表达,且能抑制人SGC7901胃腺癌细胞的侵袭和迁移。

siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响

背景：PcG蛋白是一组转录抑制因子，其核心成分EZH2在胃癌组织中表达增高，并与胃癌的进展相关。目的：应用RNA干扰（RNAi）技术研究EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响，从细胞水平探讨EZH2参与胃癌发生的机制。方法：使用EZH2小干扰RNA（siRNA）转染MKN45细胞，以实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测EZH2mRNA和蛋白表达，CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞增殖情况，流式细胞仪分析细胞周期．MatrigelTM侵袭实验检测细胞侵袭力。结果：EZH2siRNA能有效抑制MKN45细胞的EZH2mRNA和蛋白表达。与阴性对照siRNA组相比，EZH2siRNA组MKN45细胞增殖抑制率为14．7％（P＜0．05），侵袭能力显著降低[穿过Transwell小室膜细胞数：（38．5±3．4）个／HPF对（92．7±9．7）个／HPF，P＜0．05），细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。结论：EZH2siRNA可抑制人胃癌细胞的增殖和侵袭力，证实EZH2通过促进细胞增殖和侵袭在胃癌发生中发挥作用。

靶向Ang-1的siRNA片段逆转人胃腺癌细胞株BGC-823侵袭表型的研究

目的利用RNA干扰技术沉默人胃腺癌细胞株BGC-823中血管生成因子1(Ang-1)的表达,观察其对肿瘤侵袭性的抑制效果。方法设计靶向Ang-1的siRNA片段并转染人胃腺癌细胞株BGC-823;RT-PCR方法检测Ang-1的mRNA水平;Western Blot和细胞免疫荧光方法检测整合素β1、CD44V6和Ang-1的蛋白表达量和细胞定位;细胞黏附试验检测转染前后细胞黏附能力;Matrigel胶及Transwell双室培养体系检测癌细胞侵袭能力。结果 RT-PCR结果显示所设计的siRNA片段可有效沉默Ang-1的mRNA表达;整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白主要定位于肿瘤细胞胞浆和胞膜,其表达水平较转染siRNA片段前均有不同程度降低;细胞黏附能力和侵袭能力均明显降低(P<0.01)。结论靶向Ang-1的siRNA技术可有效降低人胃腺癌细胞株BGC-823的侵袭能力,为胃癌基因治疗提供了新的思路。

腺病毒介导的靶向性Akt2 shRNA抑制胃癌SGC-7901细胞侵袭的体外研究

目的构建靶向Akt2基因的腺病毒介导的shRNA,观察其转染胃癌SGC-7901细胞后对胃癌细胞侵袭能力的影响。方法构建Akt2基因的靶向性shRNA腺病毒载体,同时将空载腺病毒(pEGFP,空载体组)分别转染SGC-7901细胞。实验分为对照组、空载体组和Akt2 mRNA组。运用实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法比较Akt2表达的差异;用Transwell检测细胞的侵袭能力。结果与对照组比较,Akt2 shRNA组Akt2 mRNA和蛋白的表达分别是对照组的0.26倍和0.31倍(P<0.05),对照组与空载组无明显差异(P>0.05);Akt2表达下降后,穿透基底膜的细胞数下降>50%。结论 Akt2靶向shRNA能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中Akt2的表达,并抑制胃癌细胞的体外侵袭能力。靶向Akt2基因有可能成为治疗胃癌的新途径。

沉默乙酰肝素酶对人胃癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的:探讨RNA干扰沉默乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因表达对人胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。方法:根据人HPA基因序列转录RNA的位置及小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)设计原则,设计了4个靶位点,并构建了4个分别针对靶位点的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的质粒表达载体,同时合成了阴性和阳性对照质粒表达载体。采用阳离子脂质体法将以上质粒转染入人胃癌SGC-7901细胞,分别采用RT-PCR和Western印迹法检测转染前后HPA mRNA和蛋白表达的变化,选出对HPA沉默效果最佳的质粒,再应用Transwell小室基质侵袭实验和划痕损伤实验分别研究HPA表达沉默后对人胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移能力的影响。结果:质粒载体pGPU6/GFP/Neo-HPA-1085沉默人胃癌SGC-7901细胞HPA mRNA和蛋白表达的效果最好。pGPU6/GFP/Neo-HPA-1085转染组中穿透Transwell小室基质的SGC-7901细胞数(289.90±18.11)明显高于对照组(44.00±15.22)(P<0.05),SGC-7901细胞的迁移距离在48、72和96h内pGPU6/GFP/Neo-HPA-1085转染组明显低于对照组(P<0.05)。结论:RNA干扰技术可沉默人胃癌SGC-7901细胞中HPA mRNA和蛋白表达,从而抑制SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力。HPA可能是治疗胃癌侵袭和转移的一个新靶点。

hnRNPA1在人胃癌细胞株BGC-823中的生物学功能

核不均一核糖核蛋白A1(hnRNPA1)是体内重要的RNA结合蛋白,通过调节pre-mRNA和mRNA参与转录和转录后调控过程,与肿瘤发生、发展密切相关。目前对hnRNPA1与胃癌的关系尚不十分清楚。目的:探讨hnRNPA1在人胃癌细胞中的生物学功能,明确其与胃癌的关系。方法:以蛋白质印迹法检测正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1和人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823中的hnRNPA1表达。构建靶向hnRNPA1基因的siRNA重组质粒并稳定转染BGC-823细胞,以稳转空质粒pU6的细胞株作为对照,蛋白质印迹法验证干扰效果。分别以CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验和流式细胞术分析各组BGC-823细胞的增殖、迁移、侵袭能力和细胞凋亡情况。结果:hnRNPA1在3株人胃癌细胞株中均呈高表达,BGC-823细胞表达水平最高。与pU6稳转组相比,siRNA hnRNPA1稳转组BGC-823细胞增殖抑制率为36.3%,细胞迁移[(5.44±0.25)μm/h对(9.37±0.49)μm/h,P<0.01]和侵袭(穿膜细胞数146.30±12.56对312.51±9.62,P<0.01)受抑,细胞凋亡率降低(3.6%±0.3%对12.7%±0.2%,P<0.01)。结论:hnRNPA1在人胃癌细胞中呈高表达,其可能通过促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭,在胃癌侵袭和转移过程中发挥作用。

核抗原Mina53在人胃癌细胞中的作用及其意义探讨

背景:核抗原Mina53基因为原癌基因Myc的下游直接靶基因之一,在一些消化系统恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤增殖、侵袭、转移或患者生存期相关。目的:研究Mina53在人胃癌细胞中的作用及其对胃癌发生、发展的意义。方法:选择Mina53表达水平较高的人胃癌细胞株SGC7901和AGS,应用RNA干扰技术下调其Mina53表达,以转染无关序列siRNA的细胞作为对照组。采用CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,细胞侵袭和迁移实验检测细胞侵袭、迁移能力。结果:与相应对照组相比,Mina53 siRNA转染组SGC7901、AGS细胞增殖受抑(96 h相对增殖率:60%和68%),并发生明显细胞周期G1期阻滞(SGC7901细胞G1/G2:2.76±0.12对1.86±0.06,P<0.05;AGS细胞G1/G2:1.78±0.13对1.34±0.05,P<0.05),细胞凋亡率分别增加9.8%±1.2%和10.6%±1.5%(P<0.05),穿透Transwell小室基质胶细胞数(SGC7901细胞:11.67±0.88对24.33±1.45,P<0.05;AGS细胞:8.00±1.15对20.33±1.73,P<0.05)和穿透Transwell小室微孔膜细胞数(SGC7901细胞:7.00±1.53对14.67±2.03,P<0.05;AGS细胞:8.00±1.16对15.33±1.45,P<0.05)均显著减少。结论:Mina53对人胃癌细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡以及侵袭、迁移能力具有调控作用,可能影响胃癌的生长、浸润和转移,有望作为胃癌基因治疗的靶点。

MACC1基因下调对胃腺癌细胞的生长抑制作用

目的研究下调MACC1表达对胃腺癌细胞株MGC-803生长作用的影响。方法设计并合成RNAi干扰片段,脂质体介导MACC1-si RNA1(MACC1-si RNA1组)和MACC1-si RNA2(MACC1-si RNA2组)转染MGC-803细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用q RT-PCR检测转染后各组MACC1的m RNA表达,噻唑蓝比色实验、平板克隆形成实验和流式细胞周期实验检测RNAi转染后MGC-803细胞增殖能力的变化,Western blot检测转染后MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc蛋白的表达,并进行比较分析。结果与对照组相比,MACC1-si RNA1组和MACC1-si RNA2组MACC1表达在m RNA及蛋白水平下降,细胞的增殖速度变慢,单克隆形成数量减少,细胞周期中G1期细胞的比例显著升高,P21的表达增加,MACC1、CDK4、CCND1和c-myc的表达减少。结论下调MACC1能使MGC-803细胞的细胞周期进程受阻,抑制细胞的增殖,MACC1可以作为治疗胃癌的有效靶点。

RNA干扰技术对卵巢上皮性癌细胞基质金属蛋白酶9基因表达及侵袭和黏附能力的影响

目的探讨以基质金属蛋白酶(MMP)9基因为靶向的 RNA 干扰(RNAi)技术对 MMP-9基因在卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞中表达的抑制作用,以及对卵巢癌细胞侵袭和黏附能力的影响。方法以 MMP-9基因为靶基因,在编码区选择4个不同的目标序列,分别为 Site1、Site2、Site3、Site4及1个非特异性序列 Site5,利用 PCR 方法构建小分子干扰 RNA(siRNA)表达元件,转染卵巢癌 HO-8910PM 细胞,并依据序列不同将细胞分组,分别为 Site1、Site2、Site3、Site4和Site5组,另以未转染的母代细胞作为对照组。利用 RT-PCR、蛋白印迹法检测 MMP-9 mRNA 及蛋白的表达,通过四甲基偶氮唑蓝法绘制细胞生长曲线,细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭能力,通过细胞黏附实验检测细胞体外黏附能力。结果 Site1、Site2、Site3、对照组细胞 MMP-9 mRNA 的相对表达水平分别为0.64±0.06、0.47±0.07、0.55±0.10、0.91±0.08,蛋白的相对表达水平分别为0.30±0.09、0.27±0.08、0.37±0.12、0.63±0.09,与对照组细胞比较,Site1、Site2、Site3组 MMP-9 mRNA 和蛋白的相对表达水平均有不同程度的下降(P<0.05),针对 Site2序列的 siRNA 的基因抑制效果最好。细胞生长曲线显示,Site1、Site2、SitP3、Site4组细胞的生长不同程度的减慢。Site1、Site2、Site3组细胞的侵袭抑制率分别为50.0%、50.0%和37.5%,均高于对照组细胞(0),分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。Site1、Site2、Site3、Site4组细胞60min 时的黏附抑制率分别为43.8%、48.8%、33.9%和24.2%,90min 时的黏附抑制率分别为41.6%、40.2%、35.1%和16.0%,黏附抑制率均高于对照组(0),差异有统计学意义(P<0.05)。结论卵巢癌 HO-8910PM 细胞中存在 RNAi 现象,MMP-9siRNA 能特异性地抑制 MMP-9基因的表达,使卵巢癌细胞的侵袭和黏附能力受到不同程度的影响。

shRNA介导沉默肺腺癌转移相关转录本1表达对人卵巢癌细胞株OVCAR3侵袭与转移的影响

目的检测肺腺癌转移相关转录本1（MALAT-1）在人卵巢癌细胞株中的表达，并探讨shRNA介导沉默MALAT-1表达对卵巢癌细胞OVCAR3生物学功能的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测ES-2、SKOV3、OVCAR3、A27804株卵巢癌细胞中MALAT-1mRNA水平的表达差异，设计构建4条特异性干扰MALAT-1表达的shRNA—pGPU6／GFP／Neo表达载体和-条不干扰任何基因表达的空载体作为阴性对照，转染高表达MALAT-1的OVCAR3细胞，qRT-PCR筛选并鉴定有效沉默MALAT-1的shRNA序列。应用CCK-8比色法、体外黏附与划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测MALAT-1沉默后OVCAR3细胞生长增殖、黏附、划痕修复、迁移及侵袭能力的改变。结果筛选出高表达MALAT-1的OVCAR3细胞株，有效沉默MALA-1基因后，OVCAR3细胞株的增殖、划痕修复能力明显抑制，黏附能力有不同程度降低。Transwell迁移实验中，干扰组转入底层膜细胞数量为（52．17±4．48）个，低于阴性对照组的。（286．50±12．23）个和空白对照组的（295．67±6．96）个；在Transwell侵袭实验中，干扰组转入底层膜细胞数为（37．33±2．40）个，低于阴性对照组的（239．00±15．72）个和空白对照组的（222．67±20．85）个，干扰组与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．001）。结论利用shRNA介导沉默MALAT-1的表达可以有效抑制卵巢癌细胞株OVCAR3的增殖、黏附、划痕修复以及迁移、侵袭能力，MALAT-1有望成为卵巢癌治疗的有效靶基因。

组织因子基因siRNA对胃癌侵袭力的影响

目的探讨应用RNA干扰技术抑制胃癌细胞组织因子(TF)基因表达对胃癌侵袭能力的影响。方法构建pSUPER/TF-siRNA重组载体,并将其转染入胃癌细胞SGC-7901中;RT-PCR和Western blot检测转染前后TF的表达水平;应用Boyden小室检测对胃癌细胞的侵袭能力。结果双酶切鉴定重组载体构建成功。RT-PCR和Western blot检测显示pSUPER/TF-siRNA1重组载体明显抑制SGC-7901细胞TF基因的表达(P<0.05)。Boyden小室体外侵袭实验证实,转染pSUPER/TF-siRNA1质粒的SGC-7901穿膜细胞均数较其他无干扰组的细胞均数明显减少(P<0.05)。结论以TF基因作为靶点应用RNA干扰技术抑制其表达可降低胃癌细胞体外侵袭移能力,故其有望成为胃癌治疗的一个新靶点。

锌指转录因子Snai1通过E-钙黏蛋白调控胃癌侵袭及淋巴结转移

目的 探讨锌指转录因子Snai1在胃癌发生发展中的作用,以及胃癌组织中Snai1与E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达的关系.方法 收集本院普外科2010年1月至2012年1月收治的65例胃癌患者手术切除的胃癌组织及邻近的正常胃黏膜组织,免疫组织化学检测Snai1和E-cadherin的表达.体外培养人胃腺癌细胞株SGC-7901,分为3组：空白对照组不进行转染,阴性对照组转染不含靶向作用于Snai1的siRNA的空质粒,转染组转染靶向作用于Snai1的siRNA.转染结束后实时定量PCR和免疫印迹法检测3组细胞Snai1和E-cadherin的表达.结果 胃癌组织中Snai1表达阳性率较正常胃黏膜组织明显增高（58.5％比0.0％,P＜0.001）,而E-cadherin表达阳性率明显降低（43.1％比100.0％,P＜0.001）.Snai1阳性和阴性的胃癌组织中E-cadherin表达的阳性率分别为28.9％ （11/38）、63.0％（17/27）.Snai1阳性的胃癌患者较Snai1阴性的胃癌患者淋巴结转移率明显升高（78.9％比40.7％,P＜0.001）.体外细胞实验显示,空白对照组与阴性对照组比较,Snai1和E-cadherin的表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；与空白对照组比较,转染组Snai1 mRNA和蛋白表达下调,而E-cadherin mRNA和蛋白表达上调（均P＜0.05）.结论 Snai1可通过抑制E-cadherin表达,促进胃癌发生局部浸润及淋巴结转移.

核糖核酸干扰沉默生长抑制因子1基因表达对胃腺癌AGS细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰沉默生长抑制因子1（ING1）基因表达对胃腺癌AGS细胞凋亡的影响。方法人胃腺癌细胞株AGS经常规培养后分为空白对照组、阴性对照组[转染阴性对照小干扰RNA（siRNA）序列]、siRNA组（转染特异性ING1 siRNA序列）。应用免疫荧光、定量PCR和免疫印迹方法检测转染后不同时间的ING1基因表达沉默效果。应用流式细胞技术检测ING1基因表达沉默对AGS细胞凋亡的影响。结果ING1主要在AGS细胞胞质中表达。在荧光定量PCR技术检测中将空白对照组的ING1基因表达量设为1，则转染后24和40h阴性对照组的ING1基因相对表达量分别为0．88±0．16和0．92±0．13，siRNA组ING1基因相对表达量分别为0．38±0．09和0．17±0．06。空白对照组和阴性对照组比较，P值分别=0．78和0．82。空白对照组和siRNA组比较，P值均=0．01。阴性对照组和siRNA组比较，P值分别=0．02和0．01。免疫印迹技术检测结果显示，转染后40hAGS细胞中ING1蛋白表达水平明显下调。空白对照组AGS细胞凋亡率为11．06％±0．97％，阴性对照组、siRNA组转染40h后AGS细胞凋亡率为11．82％±0．69％和6．70％±0．41％。空白对照组与siRNA组比较P=0．024。空白对照组与阴性对照组比较P=0．76。阴性对照组与siRNA组比较P=0．019。结论ING1在人胃癌细胞凋亡过程中发挥重要作用，可能成为胃癌基因治疗的新靶点。

神经导向分子Semaphorin 5A在人胃癌侵袭和转移过程中作用的研究

目的探讨神经轴突导向分子Semaphorin5A表达与胃癌患者临床病理特征的关系及其在胃癌侵袭和转移过程中的作用。方法使用免疫组织化学方法检测Semaphorin5A在171例不同性别、年龄、组织学类型和TNM分期胃癌患者组织中的表达。使用Western印迹方法检测Semaphorin5A在具转移能力的胃癌细胞株（SGC7901和MKN-45）和无转移能力的胃癌细胞株（SNU-1和AGS）中的表达情况。运用RNA干扰技术构建Semaphorin5A—siRNA表达载体并转染胃癌细胞株SGC7901，建立Semaphorin5A稳定低表达的胃癌细胞株，经细胞粘附实验、划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测Semaphorin5A基因沉默后对胃癌细胞粘附、运动和侵袭的影响。结果Semaphorin5A表达水平与胃癌分化程度（x2=6．32，P=0．01）、胃癌淋巴结转移（x2=7．68，P=0．01）和远处转移（x2=13．6，P=0．00）有关，与患者年龄（x2=0．21，P=0．79）、性别（x2=1．79，P=0．15）和胃癌浸润深度无关（x2=1．34，P=0．55）。SGC7901和MKN-45细胞株中Semaphorin5A的表达水平明显高于SNU一1和AGS细胞株（P〈0．01）。Semaphorin5A基因表达沉默可抑制胃癌细胞的粘附、运动和侵袭能力。结论Semaphorin5A可能通过提高胃癌细胞粘附、运动和侵袭能力，在胃癌侵袭和转移过程中发挥促进作用。