出血性大肠杆菌O157：H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50LD50的EHECO157∶H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短。结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

出血性大肠杆菌O157 eae-stx1/2B融合基因的构建和表达

构建表达eae和stx1/2B的融合基因,克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分,以正确地阅读框定向插入到含有stx1/2B融合基因的质粒,构建重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50.67%。由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成,可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体,在E-HECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

EHECO157∶H7stx基因缺失突变株的构建及其特性

针对肠出血性大肠杆菌 (EHEC) O1 5 7∶H7的 stx基因 ,通过 PCR扩增出缺失了 1 83bp的 stx基因片段 ,将其克隆到自杀性载体 p CVD4 4 2中 ,然后通过接合性转导将重组自杀性质粒 p CVD4 4 2∷Δstx从大肠杆菌 SM1 0转到 O1 5 7∶ H7中 ,利用抗性标记和 PCR方法筛选出 O1 5 7∶ H7stx基因缺失突变菌株。Vero细胞毒性试验证实 ,该突变株不能产生完整的 Stx。动物试验表明 ,与强毒株相比该突变株的致病性明显降低。该突变株的构建为研究志贺毒素在 EHEC O1 5 7感染中所起的作用和研制 O1 5

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被壮观霉素(Spc+)、庆大霉素(Gm+)和卡那霉素(Kan+)基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,O157:H7(△hly△stx△toxB)检测不到相应的Stx、Hly和ToxB蛋白。O157:H7(△hly△stx△toxB)生长特性与亲本株无明显差异。对于HEp-2细胞的粘附能力明显降低。Balb/c小鼠排菌时间和排菌量明显减少和降低。本研究成功获得O157:H7(△hly△stx△toxB),并且明确Stx、Hly和ToxB的缺失导致了O157:H7对HEp-2细胞和Balb/c小鼠的粘附和定植能力降低。本研究旨在为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定物质基础。

出血性大肠杆菌O157:H7的Tir与stx1/2B融合基因的构建和表达

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157:H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗具有很大优势。方法:构建表达tir和stxb的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stxB亚基基因72个氨基酸串联,构建pET28a-stx2b-Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果:薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。结论:由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

大肠杆菌O157的志贺毒素基因克隆和测序

将一株大肠杆菌O157PCR扩增stx2基因全长并克隆测序。该菌株stx2基因与GenBank数据库收录的stx2基因最高同源性为98%,在3个核苷酸位点存在基因突变。采用邻位相连法构建进化树,序列分析结果表明O157为stx2C基因亚型。了解大肠杆菌O157的基因突变情况,并为开发大肠杆菌分子检测方法提供了参考。

重组酶聚合酶扩增检测产志贺毒素大肠埃希菌的微流控芯片技术

采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),开发产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)的等温检测方法,结合圆盘式微流控芯片快速检测目标微生物。以stx1和stx2基因为靶点,设计和筛选适宜的RPA检测引物和探针序列,验证了19株STEC菌株(含9种stx基因亚型)和21株非STEC菌株,并采用人工污染的牛肉样品对集成化的微流控芯片进行评价。筛选出检测stx1和stx2基因的高特异性引物、探针组合,与美国农业部微生物实验室技术指南中STEC定量聚合酶链式反应(real-time polymerasechainreaction,real-timePCR)方法相比,目标基因检测的包容性和排他性均为100%。荧光RPA微流控芯片法在20 min内可同时进行32个反应,可检测STEC菌体灵敏度为9.5×10^(3)CFU/mL。根据GB 4789.6—2016《食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》的规定经增菌培养后在人工污染牛肉样品中可检测1 CFU/25 g的STEC污染,方法的相对正确度和相对检出水平均为100%。本研究开发了一种荧光RPA微流控芯片检测方法,可检测常见stx基因亚型STEC菌株,操作简单、反应速度快,适用于STEC的高通量快速检测。

铅暴露对大鼠海马组织中STX基因转录水平的影响

目的检测不同神经系统发育阶段铅暴露对仔鼠海马组织中多聚唾液酸转移酶STX基因m RNA转录水平的影响,探讨铅暴露对仔鼠神经系统发育损伤的可能机制。方法实时荧光定量PCR(real-time q PCR)检测各实验组出生后1 d、3周及6周仔鼠海马组织中STX基因m RNA转录水平。结果正常Wistar大鼠海马组织中STX基因m RNA的转录水平随着仔鼠生长发育逐渐降低;母铅组1日龄仔鼠与对照组相比,STX基因m RNA转录水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);母铅组3周龄仔鼠、断乳后染铅组6周龄仔鼠分别与其对照组相比,STX基因m RNA转录水平差异无统计学意义(P>0.05);母铅6周龄仔鼠与断乳后6周龄各染铅组、对照组相比,STX基因m RNA转录水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),各时间点仔鼠1 mmol/L与2 mmol/L染铅组相比,STX基因m RNA转录水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同神经系统发育阶段,低剂量铅暴露影响仔鼠海马组织中STX基因m RNA转录水平,可能是铅暴露损害神经系统发育的原因。

非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株的志贺毒素基因变种及黏附相关基因分析

目的了解我国部分地区非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株的志贺毒素基因变种及其黏附相关基因,为进一步研究致病机制提供依据。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对29株分离菌株的stx1、stx2基因全长扩增并测序,通过与GenBank中已公布的变种序列比对确定菌株stx1、stx2基因的变种类型。对位于LEE毒力岛上的eaeA、escF、escC、tir、espA、espB、espD基因及LEE以外其他黏附相关基因iha、toxB、efa1、sfpA、lpfAO157/OI-141、lpfAO157/OI-154、saa、lpfAO113、eibG进行PCR检测。结果 25株stx1阳性菌株中有13株携带stx1a原毒素,12株携带stx1c变种;10株stx2阳性菌株中,7株携带stx2d变种,1株为stx2a原毒素,1株携带stx2g变种,1株携带与stx2eA亚单位、stx2dB亚单位最接近的stx2变种。LEE岛上的7个基因检测结果均为阴性,黏附相关基因iha阳性率为89.7%(26/29),saa阳性菌株3株、eibG阳性菌株1株,其余6个黏附相关基因均为阴性。结论我国部分非O157 STEC菌株的志贺毒素基因以stx1c、stx2d变种为主,LEE毒力岛不存在,而黏附相关基因iha广泛存在于不同血清型的产志贺毒素大肠杆菌菌株中。

3株被膜态产志贺毒素大肠杆菌产志贺毒素能力的分析

为了解食源性产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)的菌株特征及潜在致病性,分析其在被膜状态下产志贺毒素能力的变化情况。采用传统PCR技术扩增stx基因亚型,菌株1携带stx1c+stx2d亚型,菌株2携带stx1+stx2f亚型,菌株3携带stx2e亚型。多位点序列分型(MLST)结果显示3株菌株亲缘关系较远,具有遗传多样性。分别利用结晶紫染色试验和Vero细胞毒性试验探究菌株在4、10、25和37℃下被膜形成能力和产志贺毒素能力。结果表明,温度显著影响被膜形成能力和产志贺毒素能力,37℃时3株菌株的被膜形成能力和产志贺毒素能力最强。Vero细胞毒性试验结果表明,4个温度条件下,菌株2产志贺毒素能力最弱。菌株3在4个温度条件下均表现强被膜形成能力和产志贺毒素能力,尤其在4和10℃时,菌株3较其他2株菌被膜形成能力强。我国市场零售肉存在STEC污染,部分菌株具有潜在致病性,尤其是强被膜形成能力、产志贺毒素能力菌株的发现,应加强对食品加工处理过程中STEC的监测。