λ-Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞毒素stx2基因

采用PCR法合成了stx2基因上游和下游的2个同源臂序列分别为1635,1655bp。2个同源臂序列被克隆到载体pCR2.1-TOPO上,两臂中间插入庆大霉素抗性基因Gm(855bp),构建了stx2基因敲除盒子pCR2.1-B-Gm-A。将含2个同源臂和Gm抗性基因片段的扩增子电转化到含质粒pKM208的感受态细胞EHECO157:H7中,通过λ-Red重组系统产生了stx2基因敲除突变菌株。用Verocell试验检测了突变株的产毒能力并进行了细胞黏附试验。结果表明,合成同源臂利用λ-Red重组系统可以有效的敲除EHEC毒素基因,stx2基因敲除后的突变株不产stx2毒素,对真核细胞CaCo-2和Hep-2的黏附能力明显降低。

产志贺毒素大肠杆菌O138 stx2e基因的克隆与序列分析

目的构建产志贺毒素大肠杆菌O138stx2e基因重组质粒,并比较不同型Stx之间的区别。方法根据GenBank发表的stx2e序列设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增从临床分离到的产志贺毒素大肠杆菌O138的stx2e基因,将其克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,而后进行测序。并利用DNASIS序列分析软件对GenBank报道的O22菌株和噬菌体P27的stx2e和O138菌株的stx2e基因序列进行了比较分析,并对O138的stx2e氨基酸残基序列与stx1、stx2和O22菌株stx2e序列进行比较。结果所克隆的O138的stx2e与O22菌株和噬菌体P27的stx2e在碱基序列上同源性达到996%,O138的Stx2e与O22的Stx2e在氨基酸水平上其序列完全相同。Stx2e与stx2的同源性在85%以上,而stx2e与stx1的同源性只有42%左右。结论克隆了stx2e基因,为研究stx2e的结构和功能奠定了基础。

快速检测志贺毒素2基因的LAMP方法的建立

志贺毒素（Shigatoxin，Stx）又称Vero毒素，是产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Ecoli，STEC）重要毒力因子之一，具有细胞毒性、肠毒性、神经毒性作用，是导致被感染者出现严重症状甚至死亡的主要原因，因此，有必要建立敏感而快速的检测Stx方法。细菌培养方法需要耗费3d，而快速检测方法如ELISA需要高浓度的病原菌才能检测到。

志贺氏菌样毒素Stx2e缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

水肿病是能由产志贺样毒素型大肠杆菌产生的Stx2e毒素引起的一种细菌传染病,对断奶仔猪有较高的致死率,常造成较大的经济。当前,Stx2e毒素影响病原菌与靶细胞之间的相互作用机制不明确,Stx2e基因缺失株作为后选疫苗的潜力有待确认。本研究中我们利用Red重组系统构建了大肠杆菌1522(serotype O139:K12:H1)和1525(serotype O157:H19)的Stx2e基因缺失株,并通过PCR检验,DNA测序手段以及Vero细胞毒性试验在细胞水平加以验证。研究发现,在同样的培养条件下,1522△Stx2e株的生长特性与原型株相比没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变,但是相较野生株,Stx2e基因缺失株粘附猪肠上皮细胞IPEC-J2的能力大幅度降低,可达30%。将表达K99菌毛操纵子基因克隆入1522△Stx2e中,该重组菌能够同时表达K99菌毛和自身的F18菌毛基因,且该重组株的粘附IPEC-J2细胞能力相较原型株增强近1倍。

产志贺毒素大肠杆菌O18 XZ113株主要毒力基因eaeA、stx2、ehxA突变株的构建及其对小鼠的致病作用

【目的】探讨毒力基因eaeA、stx2、ehxA与产志贺毒素大肠杆菌O18致病力的关系。【方法】利用λ-Red重组系统,构建STEC XZ113株eaeA、stx2、ehxA基因缺失突变株并进行一系列生物学特性的研究。【结果】细胞粘附试验表明突变株XZ113△eaeA对HEp-2细胞的粘附能力明显降低;Vero细胞毒素试验表明突变株XZ113△stx2失去了使Vero细胞发生病变的能力;溶血活性试验表明突变株XZ113△ehxA无法在血平板上产生溶血圈,丢失了溶血能力。回复株在以上表型方面与野生株XZ113一致;与亲本株的体外竞争试验结果表明,突变株竞争力减弱,体内竞争结果表明突变株XZ113△eaeA被中度致弱;突变株XZ113△stx2和突变株XZ113△ehxA被高度致弱。【结论】stx2、ehxA基因在STEC O18 XZ113株的致病过程中发挥着更为重要的作用。

可视化环介导等温扩增法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的建立可视化环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)。方法以stx1/2基因作为检测靶基因,利用羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)指示剂,建立一种可视化检测STEC的LAMP方法。同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法相比较,并对人工污染STEC的脱脂乳进行检测。结果建立的可视化LAMP方法在64℃反应50 min后可凭肉眼观察(紫罗兰色到天蓝色)判定结果。该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应,可以准确区分STEC与非STEC菌。Stx1-LAMP和stx2-LAMP的检出限分别为3.54×10^(‒4)和3.54×10^(‒5) ng/µL,而常规PCR中stx1和stx2的检出限分别为3.54×10^(‒3)和3.54×10^(‒2) ng/µL,即stx1-LAMP检测方法的灵敏度是stx1-PCR的10倍,stx2-LAMP检测方法的灵敏度是stx2-PCR的1000倍。对人工污染STEC菌牛奶样品进行检测,stx1-LAMP和stx2-LAMP分别可检测到细菌浓度为10^(3)和10^(2) CFU/mL的加标样品。结论本研究为STEC菌株提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低,适用于现场和基层检测的可视化LAMP检测方法。

琼脂糖凝胶电泳与核酸印迹杂交法检测细菌毒力基因PCR产物的灵敏度比较研究

目的探讨核酸印迹杂交法在检测细菌毒力基因方面的应用价值。方法分别以10倍连续稀释的O157∶H7肠出血性大肠埃希菌和血清2型猪链球菌染色体提取物为模板,与志贺毒素2基因(stx2)和荚膜多糖2J基因(cps2J)特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)。用1%琼脂糖凝胶电泳及核酸印迹杂交法检测PCR产物,比较两种方法的最低检测限。结果 1%琼脂糖凝胶电泳对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7×102cfu(56.87 pg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.3×102 cfu(12.65 pg)/PCR体系;核酸印迹杂交法对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7×10-1 cfu(56.87 fg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.3×10-1 cfu(12.65 fg)/PCR体系。结论用核酸印迹杂交法检测肠出血性大肠埃希菌stx2基因和猪链球菌cps2J基因PCR产物的灵敏度均比普通琼脂糖凝胶电泳检测法高了1000倍。