细毛羊育种目标性状的相关关系及差异分析

【目的】研究苏博美利奴羊和中国美利奴羊(新疆型)周岁母羊各育种目标性状间的相关及差异性,分析各性状间的遗传规律,为提高新疆细毛羊的育种进程提供科学依据。【方法】收集、测量并整理共计1546只周岁母羊(苏博美利奴羊497只,中国美利奴羊(新疆型)1049只)的个体鉴定记录和剪毛记录,测定平均纤维直径、纤维直径标准差和纤维直径变异系数。利用SPSS 25.0软件,对毛用性状(平均纤维直径、纤维直径标准差、纤维直径变异系数、毛长、剪毛量)、繁殖性状(出生类型)以及生长性状(体格评分、鉴定时体重)数据进行描述性统计,分析各性状间相关关系,采用单因素方差分析(ANOVA)不同品种以及不同类型间的差异。【结果】苏博美利奴羊和中国美利奴羊(新疆型)出生类型与相关毛用性状(平均纤维直径、纤维直径标准差、纤维直径变异系数和毛长)以及生长性状(体格评分和鉴定时体重)均无显著差异(P>0.05),苏博美利奴羊和中国美利奴羊(新疆型)两品种间鉴定时体重均与平均纤维直径、毛长以及剪毛量等毛用性状呈极显著相关(P<0.01),各毛用性状间存在不同程度的相关性。【结论】苏博美利奴羊在毛用性状(平均纤维直径和纤维直径标准差)和生长性状(鉴定时体重)均优于中国美利奴羊(新疆型),平均纤维直径的范围在16.86~19.01μm,属优质超细型细毛羊。

基于miRNA测序数据解析苏博美利奴羊毛囊发育分子机制

【背景】羊毛由毛囊(hair follicle,HF)产生并控制,HF结构功能和形态发生是一个复杂的生物过程。细毛羊胚胎期HF发育过程决定了羊毛的产量和品质。苏博美利奴羊是我国自主培育的羊毛细度达17—19μm的精纺用超细毛羊新品种。超细毛羊HF形态发生过程中miRNA及其调控机制有待更为深入的研究。【目的】解析超细毛羊早期HF发育中miRNA的分子调控机制对于更好地理解HF形态发生过程以及对细毛羊的育种工作具有重要的指导意义,为解析超细毛羊HF发育分子调控机制和选育优质超细毛羊提供可参考的分子标记。【方法】对相同饲养条件下的苏博美利奴羊进行同期发情和人工授精,授精日被指定为胚胎第0天(E0)。在胚胎期第65天(E65)、85天(E85)、105天(E105)和135天(E135)将妊娠母羊安乐死后进行剖宫产收集胚胎的皮肤组织;在羔羊出生后第7天(D7)和30天(D30)采集左侧肩胛部皮肤组织,每个时期采3个样本。运用miRNA-Seq鉴定毛囊发育不同时期的保守miRNA和Novel miRNA,并构建苏博美利奴羊HF发育不同时期的皮肤组织miRNA文库。对差异表达miRNA(DE-miRNA)进行靶基因预测及生物信息学分析,筛选参与超细毛羊HF发育的关键miRNA和候选基因,并构建miRNA-靶基因调控网络。运用RT-qPCR和双荧光素酶报告基因检测方法验证miR-433-3p与NOTCH1的靶向关系。【结果】构建了苏博美利奴羊HF发育不同时期18个皮肤组织miRNA文库,并筛选出87个DE-miRNA和446个Novel DE-miRNA。对DE-miRNA聚类分析可知毛囊诱导分化阶段(E65、E85、E105)有21个DE-miRNA,其中有5个(oar-miR-23b、oar-miR-133等)是关键候选miRNA;毛囊成熟阶段(E135、D7、D30)有28个DE-miRNA。SOM分析结果表明DE-miRNA可聚为10个Cluster,每个Cluster中miRNA有相似功能。对DE-miRNA和Novel DE-miRNA进行混合预测靶基因并进行功能富集发现靶基因主要富集通路有AMPK、Notch、hedgehog。将DE-mRNA与靶基因结合生物信息学分析构建了与HF发育相关的miRNA-靶基因调控网络。在293T细胞中将NOTCH1野生型和突变型载体与miR-433-3p mimics和mimics-NC共转染,结果表明NOTCH1为miR-433-3p的靶基因。【结论】构建了苏博美利奴羊毛囊发育不同时期miRNA表达谱,分析了miRNA及其靶基因的表达调控关系,并构建了miRNA-靶基因调控网络,进一步了解了miRNA在毛囊发育不同时期的作用及分子机制;为解析超细毛羊毛囊发育分子调控机制和选育优质超细毛羊提供可参考的分子标记。

不同羊毛纤维直径细毛羊MYL6基因克隆及差异表达研究

试验以苏博美利奴羊为研究对象,探讨肌球蛋白轻链6(MYL6)基因在不同羊毛纤维直径的苏博美利奴羊中的表达模式。通过克隆肌球蛋白轻链6(MYL6)基因,结合生物信息学方法对其进行遗传进化和理化性质分析,且预测其二级蛋白结构,又通过RT-PCR相对定量方法以2^(-△△ct)值检测MYL6基因在苏博美利奴羊上的表达规律。结果表明:苏博美利奴羊MYL6基因大小为152036915 bp,MYL6基因的CDS全长序列为696 bp,共编码了105个氨基酸,与绵羊、山羊、牛、猪、老鼠、兔子、鸡、狗和斑马鱼的CDS同源分别为96%、95%、40%、40%、40%、40%、0%、60%、0%。分别在1、220~336、415~864 bp位点上有3个开放式阅读框(ORF)。遗传理化性质研究显示MYL6蛋白含有1个信号肽,在苏氨酸上有5个磷酸化位点、6个N-糖基化位点和3个O-糖基化位点,可能是一种非分泌性蛋白;MYL6蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,β-折叠区域占-2.00%;扭曲度占-0.16%;等电荷在-1.60~0.05。研究结果表明,苏博美利奴羊MYL6基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01,差异倍数为2.048)。本研究将为开展肌球蛋白轻链基因在细毛羊皮肤转录水平上的研究提供数据理论基础。

苏博美利奴羊胎儿皮肤毛囊结构及形态发育

【目的】研究苏博美利奴羊毛囊的组织结构与形态发育过程,为解析细毛羊毛囊发育的分子调控机制奠定组织学基础。【方法】采用石蜡切片技术分析胎龄为第65、85、105和135天的苏博美利奴羊胎儿头部、颈侧、颈上缘、鬐甲、背部、体侧、肩甲、腹部、荐部及股部等10个不同部位皮肤的组织学特性。【结果】苏博美利奴羊毛囊结构同其它动物一样,由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干等几部分组成。在胎龄65d时初级毛囊(primary follicles,PF)已经发生形成毛芽,毛芽延长,继续向真皮层深入,形成柱状结构,通过由大量真皮细胞在末端聚集,形成帽子结构,各部位表皮均形成完整的结构。胎龄85d时毛囊上部形成一个膨大部,在毛乳头上方形成锥形结构,毛球基本形成,毛乳头长度明显大于宽度;在初级毛囊基底部可见次级毛囊(secondary follicles,SF)的囊泡结构,并形成皮脂腺原始细胞。在胎龄105d时次级毛囊大量形成,伴随着初级毛囊毛芽伸长,次级毛囊毛芽向真皮层深入,毛乳头直径逐渐增大,皮脂腺开始形成;原始次级毛囊颈部隆突部开始再分化出再分化次级毛囊(secondary-derived follicles,SD),并可见汗腺,毛管发育完整;已形成完整的毛囊群结构,主要为三元毛囊群,每个毛囊群由1—3个初级毛囊和围绕其周围的几个次级毛囊组成。胎龄135d时大量形成再分化次级毛囊,形成成熟的汗腺,大部分初级毛囊和部分次级毛囊发育成熟,毛囊形成角质化毛干并穿出体表。【结论】苏博美利奴羊胚胎皮肤初级毛囊约50—55d开始形成;胎龄65—75d是初级毛囊形成的重要时期;胎龄80—85d是次级毛囊形成期,此时期,初级毛囊大量形成;胎龄105—135d是次级毛囊大量再分化,再分化次级毛囊形成及发育的关键时期。

Hoxc13基因在苏博美利奴羊胎羔生长发育期不同组织中的表达分析

【目的】分析苏博美利奴羊不同组织中Hoxc13基因mRNA的表达量差异,为分子标记辅助育种以及,研究细毛羊主要经济性状,奠定理论基础。【方法】使用RT-PCR技术检测Hoxc13基因在苏博美利奴羊65和135d皮肤、肌肉和不同内脏组织(心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏)中mRNA的表达量,并采用相对定量法对其表达量进行统计分析。【结果】在苏博美利奴羊皮肤、肌肉和不同内脏组织中均有Hoxc13基因的表达,并且在皮肤中的表达量显著高于其它组织(P<0.05),毛囊的形成和毛发生长与Hoxc13基因密切相关。【结论】建立了胎龄分别在65和135d的苏博美利奴羊,其不同组织中适于定量检测的Hoxc13基因表达量的RT-PCR方法,从分子水平探讨了苏博美利奴羊的组织器官与Hoxc13基因表达之间的内在联系。

苏博美利奴羊毛囊发育相关lncRNA与mRNA共表达网络的构建

【目的】随着高通量测序技术的发展和完善,海量的转录组测序数据随之涌现,基因网络的方法也越来越多被用于研究中;细毛羊毛囊发育受多个基因及lncRNA共同调控,单独研究某一分子并不足以发现其调控机制,本研究旨在构建毛囊发育相关lncRNA和mRNA的共表达网络,挖掘细毛羊毛囊发育的潜在候选基因。【方法】以苏博美利奴羊胎龄65 d(D65)、85 d(D85)、105 d(D105)、135 d(D135)的胎儿以及出生后7 d(A7)、30 d(A30)的羔羊肩胛部皮肤组织,每个时期有3个生物学重复,共18个样本,进行转录组测序以获得6个不同发育时期的lncRNA与mRNA表达谱数据,筛选出相邻时期的差异表达lncRNA与mRNA,运用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)方法构建共表达模块,使用DAVID在线工具进行GO(gene ontology)和KEGG pathway富集分析以找到与毛囊发育相关的模块,最后从目标模块筛选高连通度的lncRNA与mRNA使用Cytoscape软件进行网络可视化。【结果】从表达谱数据中筛选得到9070个差异表达的lncRNA与mRNA,运用WGCNA方法得到11个模块,使用DAVID富集分析发现honeydew1、paleturquoise、skyblue2模块中的基因富集在皮肤发育、毛囊发育、毛囊形态发生、Wnt信号通路负调控、细胞粘附等生物过程,以及Wnt信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、紧密连接、MAPK信号通路、ECM-受体相互作用等毛囊发育相关的信号通路,并筛选这3个模块中连通度高的lncRNA和mRNA构建了子网络,得到包括TGFB2、CTSB、SFN、SPINT1、FAM83G、GSDMA、MPZL3、VIM、CRABP1在内的毛囊发育相关基因,预测出ENSOART00000029117、TCONS00489976、TCONS00376759等24个lncRNA的可能靶基因。【结论】首次运用WGCNA方法构建了苏博美利奴羊毛囊发育相关lncRNA与mRNA的共表达网络,鉴别出3个毛囊发育相关的共表达模块,发现多个与毛囊发育相关的潜在候选基因,并预测出24个lncRNA可能的靶基因。

Dsg4基因在苏博美利奴羊毛囊发育不同时期及不同组织中的表达差异

为检测桥粒芯糖蛋白4(Dsg4)在苏博美利奴羊毛囊发育不同时期以及不同组织中的表达水平,本研究利用qPCR法测定Dsg4基因在苏博美利奴羊毛囊发育6个时期的皮肤组织,并选取毛囊发生和成熟2个关键时期进行Dsg4在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及肌肉中的表达分析。结果表明:Dsg4在各组织器官中均有表达,但在胚胎期65 d时,Dsg4在肝脏中的表达量极显著高于其他6个组织(P<0.01);在肾脏中极显著高于脾脏、肺和肌肉(P<0.01),且显著高于心脏和皮肤(P<0.05);在胚胎期135 d时,Dsg4在皮肤中的表达量极显著高于其他6个组织(P<0.01),而在其余6个组织间差异不显著(P>0.05);Dsg4的表达量随着毛囊的逐步成熟呈上升的趋势,且在出生后30 d皮肤组织中的表达量极显著高于胚胎期的表达量(P<0.01)。综上,Dsg4在苏博美利奴羊初级毛囊形成及毛囊成熟2个时期各组织器官中存在表达差异;且随着毛囊的逐步成熟,Dsg4的表达量也呈上调趋势,这提示Dsg4可能与毛囊的成熟密切相关。

苏博美利奴羊毛囊发育不同时期ncRNA调控网络的构建

为探索苏博美利奴羊毛囊发育相关ncRNA分子调控网络,本研究通过挖掘苏博美利奴羊皮肤组织样本不同时期转录组数据,利用生物信息学方法构建lncRNA-miRNA-mRNA分子调控网络。结果表明:不同时期mRNA与lncRNA及miRNA具有复杂的网络连接。通过GO富集分析发现靶基因主要参与细胞增殖调控、凋亡过程及毛囊形态发生等生物学过程;参与细胞外空间、细胞外泌体、转录因子复合体、质膜的整体成分等细胞组分;参与转录因子活性、结构分子活性、细胞外基质结构组成等分子功能。通过KEGG通路分析发现差异的靶基因主要参与TGF-beta信号通路、癌症途径、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用等多种途径。筛选寻找调控网络中的关键基因,发现G2 vs.G1组中miR-133、miR-433-5p的靶基因TGFβ2和NOTCH1参与毛囊形态发生(GO:0031069)的生物学过程,因此TGFβ2和NOTCH1为毛囊发育的关键基因。通过构建苏博美利奴羊毛囊发育相关ncRNA分子调控网络,解析毛囊发生发育的分子调控机制,从转录组学层面对毛囊生长发育进行探讨,能够对苏博美利奴羊毛囊发育的分子作用机制进行系统性挖掘。

ITGB 2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的DNA甲基化及mRNA表达水平分析

本研究旨在分析ITGB 2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的DNA甲基化和mRNA表达水平。以苏博美利奴羊周岁母羊为试验动物,以不同细度的皮肤组织样为试验样本,对ITGB 2基因(GenBank登录号:NC_040252.1)启动子区CpG岛进行预测并设计BSP引物,并对ITGB 2基因(GenBank登录号:NM_001009485.1)、GAPDH基因(GenBank登录号:NM_001190390.1)mRNA序列设计引物,采用重亚硫酸盐测序法(BSP法)进行扩增纯化后将其连接pMD19-T载体,转化JM109细胞过夜培养,形成单菌落,筛选阳性克隆菌进行测序,对所获序列进行分析,分析ITGB 2基因启动子区CpG岛在周岁母羊皮肤组织的甲基化模式,并运用实时荧光定量PCR检测ITGB 2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的mRNA表达水平。结果显示,极细组苏博美利奴羊CpG岛甲基化率(94.29%)高于极粗组苏博美利奴羊的CpG岛甲基化率(87.62%),其中,极细组苏博美利奴羊CpG2、CpG3、CpG4、CpG7甲基化率(100%、100%、100%和80.00%)均高于极粗组(86.67%、93.33%、80.00%和73.33%);ITGB 2基因在苏博美利奴羊极粗皮肤组织中的表达量极显著高于极细皮肤组织的表达量(P<0.01),且ITGB 2基因的DNA甲基化水平与mRNA表达量呈明显负相关。研究表明,DNA甲基化对皮肤生长发育有一定作用,可作为一个候选的表观遗传标记用于苏博美利奴羊。

DNMTs基因在苏博美利奴羊皮肤毛囊发育不同时期的表达分析

为探讨DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因在苏博美利奴羊皮肤毛囊不同发育时期中mRNA的表达规律,本研究选取2~3岁经产母羊,同期发情并使用同一种公羊精液进行配种,采集胚胎期65 d、85 d、105 d、135d和出生后7d、30d(分别记为G1、G2、G3、G4、G5、G6期)胎儿的皮肤组织,采用qRT-PCR检测皮肤组织中DNMTs的mRNA水平。结果表明:DNMT1在G1时期的表达量极显著高于G2、G3时期,显著高于G4、G5、G6时期;随着毛囊发育时期的变化,DNMT3a的表达量呈先上升后下降的趋势,DNMT3b表达量持续下降。在相同时期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 3个基因之间的相对表达量水平差异不显著。本研究获得了DNMTs基因在苏博美利奴羊毛囊发育不同时期的表达模式,为进一步揭示甲基化对苏博美利奴羊毛囊发育的调控机制奠定了基础。

苏博美利奴羊皮肤组织中WNT2基因的DNA甲基化与表达量分析

毛囊是皮肤的衍生物,WNT信号通路是已知与毛囊发育密切相关的通路之一,为研究WNT信号通路中关键基因WNT2的DNA甲基化和基因表达对羊毛性状的调控作用,本研究以周岁苏博美利奴羊为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序法(BSP),并结合前期MeDIP-seq结果检测了WNT2基因在第5外显子及前后100 bp处的DNA甲基化模式,通过实时荧光定量PCR法检测WNT2基因在苏博美利奴羊皮肤组织中的表达量。结果显示:WNT2基因在2组中的甲基化水平均较高,且2组的表达水平与DNA甲基化水平变化趋势一致,同时,CpG11位点的甲基化水平与表达量之间呈现显著正相关,该位点可能与羊毛纤维直径有关,表明WNT2基因的DNA甲基化水平对羊毛纤维直径有一定作用。本实验为后期深入研究DNA甲基化对毛囊的影响提供了重要参考,也为该基因的进一步研究提供理论基础。

绵羊KAP8.2基因多态性及其与毛用性状相关性分析

为了探讨绵羊角蛋白关联蛋白8.2(KAP8.2)基因mRNA 5′UTR区c.-35位点在不同群体中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及其与毛用性状的相关性,试验采用高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)法检测了苏博美利奴羊、陶赛特羊和小尾寒羊3个群体的基因多态性,并分析了各群体的基因型频率和等位基因频率,最后采用单因素方差分析法统计了苏博美利奴羊群体内不同基因型个体与毛用性状的相关性。结果表明:该基因在3个群体中存在GG、GA和AA 3种基因型,其中GA基因型频率在3个群体中均最低,且均小于10%;GG基因型频率在苏博美利奴羊群体中最高(47.66%),小尾寒羊中最低(25.00%);AA基因型频率在小尾寒羊中最高(66.67%),苏博美利奴羊中最低(46.09%)。G和A等位基因频率在苏博美利奴羊群体中基本相等,分别为0.5078和0.4922;A等位基因频率在陶赛特羊和小尾寒羊群体中分别为0.6538和0.7083,G等位基因频率分别为0.3462和0.2917。该位点在3个群体中均处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05),其中苏博美利奴羊受到最强的选择压力。单因素方差分析显示苏博美利奴羊GG基因型个体的羊毛拉伸长度显著高于AA基因型(P<0.05),说明该基因可以通过影响毛纤维拉伸长度影响羊毛品质。

苏博美利奴羊核心群级进杂交不同世代对产毛性状影响的研究

本试验旨在研究苏博美利奴羊选育过程中杂交不同世代对产毛性状的影响。选择新疆3个核心群场2.5岁母羊为试验羊,按育种进程分为基础群、级进一代、级进二代、横交一代、横交二代、横交三代、横交四代,共计7个世代组,以基础群为对照组,分别测定细度、剪毛量、净毛率、净毛量、毛长度和剪毛后体重等6个产毛性状,分析各性状遗传参数与选择进展变化曲线。结果表明:羊毛细度、毛长度随杂交世代增加呈缓慢下降趋势,细度与毛长度存在较高的遗传相关(r_A=0.388),选择细度会导致毛长度变短;各世代净毛量、剪毛后体重整体平稳,基本维持了杂交前水平。经过7个世代的选择,细度由基础群的21.18μm达到17.20μm超细毛标准,遗传进展明显;毛长由9.90 cm降至9.13 cm;净毛量由3.12 kg降至3.05 kg。结果显示,级进杂交不同世代对产毛性状有影响,选择细度会降低毛长度和净毛量。