欧美杨细菌性溃疡病菌hrcJ基因的功能分析

【目的】为了明确欧美杨细菌性溃疡病病原菌hrc J基因在致病过程中的作用,解析病原菌Ⅲ型分泌系统各基因的功能,为阐明病原菌的致病机制提供理论依据。【方法】利用同源重组原理,构建携带菌株N-5-1 hrc J基因的自杀载体p EX18Km-hrc J,运用两亲结合方法把自杀载体导入野生型N-5-1菌株中,在含有相应浓度的卡纳霉素和利福平抗生素的LB平板上筛选得到hrc J基因的插入突变体,并通过PCR和Southern杂交验证。为进一步验证p EX18Km-hrc J是否定点整合入hrc J基因,设计了2对引物组合进行PCR扩增。在室内生化培养箱内,分别以野生型菌株N-5-1、插入突变体菌株Δhrc J和互补载体菌株HBhrc J接种1年生107杨苗干,进行致病性测定。【结果】扩增出来的PCR片段大小均与预期一致,Southern杂交信号带大小与预期相同,表明自杀载体p EX18Kmhrc J正确地整合入目的基因,即hrc J基因由于发生同源交换而实现了插入突变。生物学特性测试表明:hrc J基因的插入突变体在1年生107杨苗干上的致病能力显著下降,野生型菌株N-5-1、插入突变体菌株Δhrc J和互补载体菌株HBhrc J的病情指数分别为84.4,31.1和66.7,并且丧失了在本氏烟草上的HR激发能力,功能互补突变体部分恢复至野生表型;生长能力测定显示,野生型菌株N-5-1、插入突变体Δhrc J和互补载体HBhrc J生长曲线无明显差异,在液体LB培养基中均可正常生长;通过结晶紫染色后,在培养Δhrc J、HBhrc J、野生菌株N-5-1的试管壁上均可以观察到紫色环状的生物膜形成,3种菌株的OD_(570)值相近;游动性测试表明,hrc J基因突变体的运动能力比野生菌株下降了21%。【结论】利用自杀载体p EX18Km可成功构建欧美杨细菌性溃疡病病原菌基因插入突变载体,为欧美杨细菌性溃疡病病菌的致病基因研究提供一种可选择的方法。欧美杨细菌性溃疡病菌hrc J基因与其对107杨的致病性有关,能够激发非寄主植物烟草的过敏性反应;欧美杨细菌性溃疡病菌hrc J基因突变并未影响病原菌的生长和生物膜的形成,但其游动性减弱。

欧美杨细菌性溃疡病发生与危害林间观察

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨细菌性溃疡病是2006年菏泽市新发现的一种危害杨树枝干部的毁灭性病害。林间调查发现,该病害在菏泽地区分布广泛,危害严重,病害症状表现溃疡腐烂和肿胀溃疡两种类型,每年4—10月发生,7—8月高温高湿季节是发病盛期。病害发生与林间的生态环境,传媒昆虫的种类、数量,杨树品种等因素关系密切。建议在发病初期采取刮皮涂抹多抗霉素、农用链霉素及杀虫剂,加强抚育管理等综合防控措施。

欧美杨细菌性溃疡病菌双组份系统反应调节基因LqRR2的功能研究

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现,不同于其它病原菌造成的杨树溃疡病,该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏,已造成了严重的经济损失,该病原菌的致病分子机制尚不清楚。双组分系统是细菌重要的信号传递通路,在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。开展双组份系统研究将有助于解析欧美杨细菌性溃疡病菌的致病机制。本研究鉴定了欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina双组份孤儿反应调节基因LqRR2,并对其生物学功能进行了研究。通过同源重组获得了LqRR2基因的缺失突变体△LqRR2。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,突变体△LqRR2在半固体培养基上的游动能力显著减弱,对欧美杨‘107杨’枝干的毒性也显著降低。但是,突变体的生长速率、生物膜形成能力以及胞外多糖产量较野生型无显著差别。此外,荧光定量PCR分析结果显示,游动性相关基因flg B、flg C和flg E的表达量在突变体中明显降低。综上所述,双组份调节蛋白编码基因LqRR2是欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina维持病原菌游动性和全毒性所必需的。

欧美杨细菌性溃疡病菌基因组测序与分析

欧美杨细菌性溃疡病菌(Lonsdalea populi)是引起杨树溃疡病的主要病原菌,它可引起树干形成层的破坏和树皮的局部坏死。为挖掘其致病基因,本研究利用二代和三代测序技术对欧美杨细菌性溃疡病菌N-5-1进行了全基因组测序。结果表明:该病菌菌株染色体和质粒大小分别为3832567 bp和11289 bp,GC含量分别为55.42%和56.32%。通过对基因组的分析,共预测到3556个基因,在GO、KEGG和COG数据库分别注释到2348个、2785个和2374个基因。进一步利用Ⅲ型分泌系统数据库注释到501个编码分泌蛋白的基因,在病原互作数据库中注释到了427个病原与宿主互作的基因,其中13个为效应子基因。通过与Lonsdalea属的其他病原菌的基因组进一步比较发现,菌株Lonsdalea populi N-5-1的基因组与Lonsdalea iberica LMG 26264和Lonsdalea populi L2-3的基因组存在良好的共线性关系,且与Lonsdalea populi L2-3的亲缘关系更近。本研究为解析欧美杨细菌性溃疡病菌的基因组结构、功能及亲缘关系提供了科学基础,并为后续深入研究其致病基因及开展树木抗病分子育种提供了基因组信息和基因资源。

欧美杨细菌性溃疡病传播途径研究初报

通过在养虫室内用田间病株树上发病部位采集的昆虫进行伤口和无伤接虫试验表明,四斑露尾甲(Librodor ja-ponicus)、白星花金龟(Postosia brevitarsis)是欧美杨细菌性溃疡病(Xanthomonas populi)的传播媒介;泰坦锹甲[Dorcustitanus platymelus(Saunders)]的足部检测到了病原菌的存在,这表明,泰坦扁锹甲可以携带欧美杨溃疡病病菌;通过对患病杨树周边种植的大豆进行检测,可以检测到病原菌,这表明大豆植物可能是欧美杨溃疡病菌的转主寄主。

杨树响应细菌性溃疡病菌侵染的miRNA靶基因预测及分析

欧美杨细菌性溃疡病是由Lonsdalea quercina subsp.Populi引起的枝干病害,给杨树的生长和生存带来极大危害。miRNA是植物响应逆境胁迫的重要调控分子,为鉴定杨树中响应欧美杨细菌性溃疡病菌侵染的miRNA靶基因,以期为林木抗病分子育种提供新的候选基因,本研究以miRBase数据库中杨树全部miRNA成熟序列为探针,对‘中林46’杨接种细菌性溃疡病后的差异表达基因进行了miRNA的靶基因预测。共筛选出杨树127个miRNA家族的276个miRNA对应的566个靶基因,涉及植物病原互作、植物激素信号传导和苯丙素生物合成等多个途径,表明miRNA参与了杨树对细菌性溃疡病菌侵染的响应。结合靶基因的GO分析、KEGG通路富集和基因功能注释,发现miR482、miR6459、miR7812、miR7835和miR396等通过靶定RPS2、NBS-LRR、AUX1、CCR、Ca2+跨膜运输蛋白编码基因,参与调控杨树对病菌侵染的响应。miR7835靶定的9个差异表达基因中有6个基因均编码苯丙素生物合成途径通路中的CCR酶,推测其可能影响杨树木质素合成,进而参与杨树对病菌侵染的防御反应。本研究发现的miRNA:mRNA调控基因对,丰富了林木抗病分子育种的基因资源,为林木抗病分子调控机制的研究提供了新的线索。