纳米花固定化蔗糖酶的研究

蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)在工业上具有较高的经济价值,可用于分解蔗糖生成果糖和葡萄糖,现今在工业化技术上存在着蔗糖酶生产果糖方法单一、活力不易保持且难以重复利用等问题。采用共沉淀法制备Mn_(3)(PO_(4))_(2)-蔗糖酶的纳米花固定化酶[以下简称Sucrase@Mn_(3)(PO_(4))_(2)],并对制备条件进行优化;同时对固定化酶的形态、结构进行表征,对固定化酶的动力学特性进行分析。结果表明:制得的Sucrase@Mn_(3)(PO_(4))_(2)纳米花颗粒分散,大小均匀,呈雏菊形、盛开状,且内部晶体结构完整;固定化酶有明显的Mn^(2+)、PO^(3-)_(4)、酶蛋白质的EDS特征峰及明显的酶蛋白质和磷酸根的FT-IR吸收特征;固定化酶表现出良好的温度稳定性和酸碱稳定性;Sucrase@Mn_(3)(PO_(4))_(2)被重复使用7次后其活性仍能保持其最初活力的40.38%;固定化酶在4℃保存28 d时仍保持40%的活性。

种子载体固定化微生物对油菜生长和石油烃污染土壤修复的影响

土壤中的石油烃污染物难以生物降解,影响植物生长及土壤微生物代谢活性和群落结构,种子载体固定化微生物可以协同发挥植物和微生物对石油烃污染土壤的修复作用。采用种子包衣(以硅藻土与膨润土混合物为填充剂)和微生物固定化方法研制了油菜种子载体固定化微生物材料,设置空白对照组(CK,种子与微生物均不添加)、裸种油菜(T_(1))、包衣硅藻土与膨润土的油菜种子(T_(2))、添加游离铜绿假单胞菌(T_(3))、包衣硅藻土与膨润土的油菜种子+游离铜绿假单胞菌(T_(4))、包衣硅藻土与膨润土的油菜种子固定化铜绿假单胞菌(T_(5))进行盆栽试验,测定油菜生长、根际微生物群落结构及石油烃去除效果。结果表明:1)T_(1)、T_(2)、T_(4)和T_(5)处理间种子发芽率无显著差异;与T_(1)相比,T_(4)与T_(5)处理油菜的叶长、根长、生物量及可溶性蛋白质含量显著增加,但T_(2)处理则没有显著变化;T_(2)、T_(4)、T_(5)处理油菜的叶宽、茎长、叶绿素含量及超氧化物歧化酶活性显著提高,而丙二醛含量则显著降低。2)与CK相比,T_(1)、T_(2)、T_(3)、T_(4)、T_(5)处理组对石油烃的去除率分别提高了0.8、1.6、0.5、1.8、2.2倍,T,处理石油烃去除率最高,达54.0%。各处理土壤脱氢酶活性均显著增高,且与石油烃去除率呈显著正相关(r=0.893)。3)高通量测序结果发现,T_(5)处理土壤微生物α多样性最高,绿弯菌门和酸杆菌门丰度均大于其他处理。综上,种子载体固定化微生物处理通过调控植物生长、改变微生物群落结构、提高土壤酶生物学活性,提高了石油烃的去除率,这为协同发挥植物与微生物联合修复石油烃污染土壤提供了一种环境友好型新材料。

多粘类芽孢杆菌中L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达及固定化研究

为了对D-半乳糖进行异构化制备D-塔格糖,从多粘类芽孢杆菌KF-1中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达;重组蛋白PpoLAI通过镍柱纯化,并利用壳聚糖微球进行固定化研究。结果表明:使用D-半乳糖作为底物时,PpoLAI的最佳温度和pH分别为50℃、7.0;Mn^(2+)显著激活酶活性,当Mn^(2+)的浓度为0.8 mmol/L时,PpoLAI的活性最高;以D-半乳糖为底物的PpoLAI的米氏常数和分别为161.4 mmol/L及98.84μmol/(mg·min);PpoLAI的最优固定化条件为壳聚糖的质量分数为3%,戊二醛的体积分数为3%,游离酶添加量为0.9 mg/g,吸附温度为25℃,吸附时间为4 h,PpoLAI的固定化率为80.12%,固定化的PpoLAI的热稳定性、pH稳定性与游离酶相比有显著提升。

有机相中乙醛对脂肪酶催化酯交换反应的影响研究

以戊二醛活化后的聚脲多孔材料为载体固定荧光假单胞菌脂肪酶,将得到的固定酶用于催化(R,S)-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯酯交换反应,反应过程中副产物乙醛对脂肪酶的催化活性和立体选择性会产生抑制作用。考察了乙醛存在下乙醛浓度、反应溶剂、反应温度对酶催化能力的影响。结果表明,乙醛存在下脂肪酶的催化活性和选择性受到明显抑制。当乙醛浓度为0.025 mol/L时,以正己烷为溶剂,40℃下利用固定酶催化(R,S)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯的酯交换反应,此时酶的催化活性和选择性受到的抑制最小。重复使用5次后,体系转化率由第一次49.3%下降至19.4%,对映体选择率下降至26%,表明乙醛的存在加速了酶活性的损失。

纳米花固定化葡萄糖异构酶的制备及性能分析

该研究采用共沉淀法制备了葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase,GI)纳米花,对固定化条件进行了优化,同时对纳米花固定化酶的形态特征以及酶学性质进行了探究。结果表明,40μL酶液中加入9 mL、pH值7.4的PBS缓冲液后与30μL CuSO_(4)混合,在35℃条件下静置反应18 h,制得的纳米花固定化葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase@Nano flowers,GI@NFs)的酶活回收率高达183.06%。SEM表征结果显示GI@NFs有完整的纳米花结构,傅里叶红外光谱显示GI@NFs具有酶和PO_(4)^(3-)的特征吸收,X-射线衍射结果进一步证明其载体为Cu_(3)(PO_(4))_(2)。酶学性质研究发现,GI@NFs的最适反应温度为60℃,比自由酶的提高了10℃;最适反应pH值为8,比游离酶的最适pH更高;GI@NFs的温度稳定性和pH稳定性均比自由酶的明显提高;固定化酶被循环使用8次,其酶活力仍保持最初活力的60.32%。实验结果表明,纳米花结构提高了葡萄糖异构酶的酶活,表现出较好的循环性能和稳定性,具有一定的应用价值。

改性聚乙烯膜和氧化硅固定化碳酸酐酶

分别以改性聚乙烯(PE)膜和氧化硅(SiO_(2))为载体,考察了不同方法固定化碳酸酐酶(CA)的活性,然后以聚多巴胺/聚乙烯亚胺(PDA/PEI)改性的PE和SiO_(2)固定化CA为研究对象,考察了最适反应条件及稳定性。结果表明:在相同的反应条件下,PDA/PEI-SiO_(2)固定化CA的酶活回收率最高,为58.8%,PDA/PEI-PE固定化CA的酶活回收率为17.1%,使用10次后保留活性分别为84.8%和90.2%;固定化酶的最适反应条件均为35℃、pH 8.5,与游离酶相同;在较高温度(55~65℃)和较高酸浓度(>0.010 mol/L)下的稳定性高于游离酶;Mn2+对游离酶和固定化酶活性均有显著的促进作用,K^(+)、Mg^(2+)无明显影响;PDA/PEI-SiO_(2)和PDA/PEI-PE固定化CA在4℃下贮存10 d,保留活性分别为95.2%和92.4%;当用于CO_(2)水合反应时,CaCO_(3)的生成量分别是游离CA的120%和70%。固定化CA在CO_(2)捕集的工业化应用方面具有很大潜力。

介孔分子筛SBA-15中α-胰凝乳蛋白酶组装及催化活性研究

The hexagonal silica mesoporous material SBA-15 with ordered 2-dimensional channel structure was used as a suppport to the immobilization of emzyme. α-Chymotrypsin, an enzyme, was assembled in the channel of SBA-15 by immersion method. The absorbed amount of enzyme in SBA-15 and the activity of the immobilized enzyme were studied. It was found that there was more absorbed enzyme in SBA-15 than in other carrier and the activity of the immobilized α-chymotrypsin was increased compared with the free enzyme. It suggests that silica mesoporous material SBA-15 is a good support for immobilization of enzyme.

磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体

以戊二醛为交联剂制备了磁性壳聚糖微球,并对其形貌和结构分别进行了观察和分析,结果表明,其具有较好的球形形貌,表面平滑,单分散性较好,粒径分布范围窄,平均粒径为0.9μm。以磁性壳聚糖微球为载体固定漆酶。固定化漆酶最适温度分别为10和55℃,均比游离酶降低5℃,最适pH值为3.02。在60℃条件下保温210 m in,固定化酶保留酶活力74%,而在相同条件下游离酶酶活力仅保留19.4%。固定化酶连续进行10次操作后,酶活力仍保持80%以上,漆酶使用效率明显提高,且该固定漆酶具有良好的存储稳定性。

不同疏水参数有机溶剂中木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的变化

【目的】探寻疏水参数（10gP）不同的有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影响。【方法】制备固定化木瓜蛋白酶，在疏水参数不同（logP=-1．30，-1．10，-0．76，-0．33，-0．24，0．28，0．49，0．68，0．80，1．31，1，80，2．0，2．5，3．5和5．0）的15种有机溶剂及其不同体积分数（ψ-5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％和70％）的溶液中，测定木瓜蛋白酶及其固定化酶的活性，以不含相应有机溶剂的0．1mol／LpH7．2磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液为对照，分析不同有机溶剂及其体积分数对酶活性的影响。【结果】在低疏水参数（10gP≤-0．24）的有机溶剂中，有机溶剂二甲基亚砜、1，4-二氧六环和乙腈具有在低体积分数（妒≤10％）下，激活木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的特性，有机溶剂甲醇、乙醇虽然在低体积分数（p≤10％）下不能激活木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，但其活性与对照（So—O）相当；低疏水参数有机溶剂在高体积分数（9≥30％）下抑制酶活。当有机溶剂的疏水参数为0．28～1．31时，其对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性有显著抑制作用。在有机溶剂疏水参数较高（logP≥1．80）条件下，低体积分数（9≤10％）时酶活性下降较慢，超过-定体积分数（P≥30％）后,酶活性开始升高。【结论】低logP（10gP≤0．24）有机溶剂在低体积分数（ψ≤10％）时可激活或稳定木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，而在高体积分数（ψ≥30％）时对酶活有抑制作用；中logP（0．28≤logP≤1．31）有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性具有显著抑制作用；高logP（10gP≥1．80）有机溶剂在低体积分数（ψ≤10％）时抑制木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，但在高体积分数（ψ≥30％）时酶活性升高。

超声波对固定化酶活性的影响

本文介绍了超声波对固定化酶的影响，同时对作用过程中的影响因素进行了阐述，并探讨了超声波影响固定化酶的可能机理。

环氧化硅胶固定木瓜蛋白酶及其动力学性质

以硅胶为载体 ,γ -环氧丙基氧丙基三甲氧基硅烷为偶联剂 ,对木瓜蛋白酶进行了固定化 .最适固定化条件如下 :温度为 2 5℃ ,pH为 8.0 ,时间为 18h ,酶量为每 10 0mg环氧化硅胶固定 2 4mg酶 .同时以酪蛋白为底物 ,研究了固定化条件对酶活力回收的影响 ,并比较了固定化酶和溶液酶的动力学性质 ,结果表明 :固定化酶的最适 pH和最适温度都比溶液酶有所提高 。

分子筛对葡萄糖淀粉酶的吸附性能研究

测定了黑曲霉葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)在三种改性的、具有中孔和大孔的分子筛上的吸附等温线并将吸附量和吸附等温线的形状与分子筛的等电点、孔容、孔径及酸性相关联.讨论了孔结构和不同酶吸附量对分子筛固定化葡萄糖淀粉酶活力的影响.发现葡萄糖淀粉酶在再造孔分子筛上的单层饱和吸附量与再造孔的方法密切有关,三种不同再造孔方法制得的分子筛具有不同的骨架Si/Al比、不同的孔分布和比表面积.不同的Si/Al比导致不同的酸性质和等电点.酶吸附量与载体的表面酸性、等电点以及吸附时溶液的pH有关,分子筛对酶的吸附以静电作用为主.其次,当中孔孔径和孔容越大时,单层饱和吸附量亦越大.随着分子筛对葡萄糖淀粉酶的吸附量增加,固定化酶的活力增大,但固定化酶的比活力随吸附量的增加、中孔孔容和孔径的减小而下降.

荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)的固定化及催化合成乙酸肉桂酯

为提高酶促合成食品添加剂乙酸肉桂酯的效果,选用荧光假单胞脂肪酶(PFL)为生物催化剂,肉桂醇为底物,乙酸乙烯酯为酰化试剂和溶剂,研究了PFL在反应器内壁上的固定化、及其催化转酯反应合成乙酸肉桂酯的动力学。结果表明,相对于塑料(PMMA和PET),在玻璃壁上的固定化PFL,吸附牢固,活性高。酶的固定化中,水可以明显优化PFL,但是不能稳定PFL;如果添加亲水性大分子羧甲基纤维素(CMC),则可以更好地稳定PFL。催化转酯18h,在玻璃壁上的CMC-固定化PFL可转化底物99%,再次使用时仍可转化83%的底物;而水-固定化PFL可转化底物98%,但再次使用时仅转化底物76%;酶粉转化底物86%,再次使用时转化底物62%。可见,在玻璃载体上的CMC-固定化PFL可更有效地催化合成乙酸肉桂酯。

超声场对固定化木瓜蛋白酶的影响研究

用壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶后,超声处理固定化酶能够提高其活力,但对其最适温度与最适pH没有影响。研究了超声温度、超声时间、超声频率及超声强度对固定化酶活力的影响,单因素实验表明,在水浴温度50℃,135kHz,0.45W/cm2条件下超声50min时,酶活力提高最为显著,较未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶活力提高了25.85%。研究低频槽式超声处理的固定化酶的动力学,结果显示超声处理使Km值降低,与未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%,接近游离酶的Km值,Vmax值升高了8.35%。结果表明,超声场使酶与底物的亲和力增加。

超声对包埋-交联法固定化木瓜蛋白酶催化活性的影响

研究超声对包埋-交联法固定化木瓜蛋白酶催化活性的影响。将醋酸纤维素铺制成膜,包埋木瓜蛋白酶;以戊二醛为交联剂,进行交联反应,制得固定化木瓜蛋白酶。分别研究超声频率、超声功率和超声时间对固定化酶活性的影响,再由均匀试验得到超声强化固定化木瓜蛋白酶催化活性的最优条件。经均匀试验确定最优超声条件为135kHz、0.05W/cm2、25min,相对酶活力为197.22%。验证实验证明最优的超声条件下测得固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力为182.68%,相对标准偏差为7.37%,没有显著差异。

沙蒿胶磁性微球固定化脂肪酶及部分理化性质的研究

以沙蒿多糖-壳聚糖复合磁性微球为载体,采用物理吸附法固定化脂肪酶,对固定化过程中对酶活力有影响的各种因素做了研究,同时对固定化酶的部分理化性质、最适pH、最适温度、酶的热稳定性以及表观米氏常数与游离酶做了比较。固定化酶的Km小于游离酶的Km,其最适pH和最适温度分别为8.0和50℃,而且固定化脂肪酶具有良好的热稳定性、可应用性和重复使用性。

番茄秸秆固定化芽孢杆菌M1对3环PAHs污染老化土壤修复效果

为探讨固定化微生物对煤矿区3环PAHs污染老化土壤的修复效果,以番茄秸秆为固定化载体材料,通过"吸附-包埋-交联法"形成了固定化芽孢杆菌微球,并采用土培试验对煤矿区土壤3环PAHs去除进行研究。结果表明,游离芽孢杆菌M1对煤矿区污染老化土壤单体芴(Flu)、菲(Phe)和蒽(Anth)的去除随接菌量的增加先升高后降低。在接菌量为1%、10%、20%(体积质量比)的游离芽孢杆菌处理中,10%处理(B2M1)对土壤Phe的去除率最高,为21.35%。不同接菌量的固定化芽孢杆菌M1微球处理对3种PAHs的去除率显著高于微球基质处理,其中,接菌量20%的固定化芽孢杆菌处理(X3M1)对土壤Flu的去除率最高,达95.25%,比不含M1菌株的番茄秸秆微球基质处理(X3)提高了12.03个百分点。对比分析扣除微球基质后的固定化M1与添加同等菌量的游离M1去除结果看出,经固定化后的菌株M1比游离菌M1显著促进了对煤矿区污染老化土壤3环PAHs的去除,不同接菌量对单体Flu和Anth去除率为72.17%~75.52%和8.97%~28.88%,分别比游离菌增加了64.10~72.31个百分点和8.13~15.24个百分点,单体Phe 1%接菌量处理比游离菌提高了5.07个百分点。从土壤酶活性看,土壤过氧化氢酶活性在固定化M1三种剂量处理下均显著高于微球基质和游离菌M1处理,随剂量增加依次是游离菌处理的1.16、1.23倍和1.20倍,是微球基质处理的1.28、1.19倍和1.16倍,与3环PAHs的去除率规律相一致,而固定化M1处理多酚氧化酶、过氧化物酶和纤维素酶活性相对于游离菌处理有不同程度的降低。综上,固定化芽孢杆菌M1对土壤3环PAHs去除具有显著促进作用,为煤矿区PAHs污染老化土壤原位修复的应用提供了重要技术参数与支撑。

固定化木瓜蛋白酶活性的X-射线微区分析

利用X-射线微区分析,对共价法得到的固定化木瓜蛋白酶的活性进行了分析;Na-苯甲酰-L-精氨酰胺盐酸盐作为底物,FeCl_3作为捕捉剂,底物经木瓜蛋白酶催化分解产生L-精氨酸及氨,后者和捕捉剂反应产生沉淀,可以确定固定化木瓜蛋白酶的催化活性部位。结果表明:以大孔结构吸附树脂为固定化酶载体,酶活较高,木瓜蛋白酶分布较均匀。并得到了固定化木瓜蛋白酶的活性定位的最佳条件。并对不同结构载体固定化木瓜蛋白酶的活性进行了研究。

壳聚糖及其衍生物作为固定化蛋白酶的载体

介绍了以壳聚糖及其衍生物为载体的木瓜蛋白酶、微生物蛋白酶和胰蛋白酶的固定化条件和固定化方法 ;强调了酶活力回收率、稳定性的重要性 ;指出了壳聚糖及其衍生物作为固定化蛋白酶的载体具有环保、来源丰富和可以通过多种方法进行固定化处理的优点。

超声对改性明胶固定化木瓜蛋白酶活力的影响

本文探讨了超声处理对戊二醛改性明胶包埋的木瓜蛋白酶酶解反应条件以及酶学特性的影响。采用均匀实验的方法优化超声处理固定化木瓜蛋白酶的反应条件。利用偏最小二乘回归法分析均匀实验结果,得到最优条件为:135 k Hz、0.05 W/cm2、20 min、40℃,此条件下实测相对酶活为221.25%,与理论值相对误差为3.58%。超声并没有改变固定化酶的最适p H和最适温度,即超声并不改变固定化酶的酶学特性。