O型口蹄疫病毒VP3蛋白的可溶性表达与反应原性分析

按照大肠杆菌密码子偏爱性优化合成了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP3基因,将该基因亚克隆到原核表达载体p E-SUMO中,构建重组表达质粒p SUMO-VP3,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导SUMO-VP3融合蛋白表达,在IPTG浓度0.1 mmol/L、温度16℃、诱导8 h时融合蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳及Western blot结果表明,p ESUMO-VP3重组表达载体获得的融合蛋白以可溶性表达为主,且融合蛋白均可被FMDV阳性血清识别,反应原性良好。

O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。

基于开放式三明治酶联免疫分析的雌二醇检测方法的建立

目的:通过建立开放式三明治酶联免疫分析方法(OE-ELISA),对雌二醇进行检测。方法:通过基因拼接构建质粒后在原核表达系统中制备小分子泛素相关修饰物蛋白-大肠杆菌麦芽糖结合蛋白-抗体轻链可变区(sumo-MBP-VL)和碱性磷酸酶-抗体重链可变区(ALP-VH)融合蛋白,并从产量和可溶性角度对两种蛋白的表达条件进行优化。将得到的两种蛋白纯化后分别作为包被抗体和酶标抗体,建立检测雌二醇的OE-ELISA方法。应用竞争ELISA和OE-ELISA测定不同浓度的雌二醇标准品,绘制标准曲线并计算两种方法的敏感性。结果:在质粒中加入sumo标签后,实现了sumo-MBP-VL融合蛋白的可溶性表达。在Rosetta宿主菌中37℃诱导后得到大量的ALP-VH和sumo-MBP-VL融合蛋白。OE-ELISA测定雌二醇标准品的标准曲线为y=0.0296x+1.3029,r^(2)=0.9961,敏感性为532 pg/mL,优于竞争ELISA 803 pg/mL的敏感性。结论:成功建立了检测雌二醇的OE-ELISA方法。

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其结构蛋白VP2可溶性表达的调控

为了研究猫泛白细胞减少症病毒(FPV)的生物学特性,可溶性表达FPV结构蛋白,研发基于VP2的新型亚单位疫苗,采集40份疑似FPV阳性的中华田园猫粪便样本,通过qPCR对样本检测后利用细胞培养、血凝试验、PCR和电镜观察等试验鉴定分离株,并对其VP2基因进行同源性比对。同时,构建pET-28a-VP2、pET-28a-SUMO-VP2和pET-22a-SUMO-VP2重组质粒并利用大肠杆菌进行表达。结果显示,成功分离出1株FPV毒株;生物信息学分析表明,该毒株的VP2基因与此前报道的毒株同源性高达99%。蛋白表达结果显示,单独使用SUMO标签对VP2蛋白的可溶性表达影响较低;然而,当带有SUMO标签的重组质粒与4个分子伴侣(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)分别共表达时,可溶性VP2的表达量可显著提高。该研究可为FPV亚单位疫苗研发提供数据和有效的生物材料。