去SUMO化酶SENP5的表达、纯化、活性测定及复合物重组

SENP5参与转录调控、蛋白质稳态、DNA修复和细胞分裂等重要生命过程,与癌症、发育缺陷和神经变性等疾病密切相关.SENP5包含N端的无规则卷曲和C端的催化结构域.研究对SENP5的催化结构域(SENP5CD)进行了表达和纯化.C末端水解活性实验表明SENP5CD对SUMO2前体(pSUMO2)的切割活性大于SUMO1前体(pSUMO1).分子筛实验证明,SENP5能够与SUMO1和SUMO2的前体、RanGap1-SUMO1和RanGap1-SUMO2形成稳定的复合物.实验构建了SUMO1-PA和SUMO2-PA活性探针,这2种活性探针都能与SENP5CD反应形成共价结合的复合物.通过比较AlphaFold预测的SENP5CD-pSUMO1和SENP5CD-pSUMO2复合物结构,发现pSUMO2与SENP5CD的结合比pSUMO1更紧密.研究表达、纯化了SENP5,鉴定了酶活性,获得了SENP5CD与底物的复合物,为进一步研究SENP5奠定了基础.

sumo化及sumo化修饰酶对糖尿病肾病NF-κB信号通路的调控

核转录因子(nuclear factorκb,NF-κB)是公认的炎症和免疫反应的调节因子,与糖尿病肾病的发生发展密切相关。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,sumo)参与了NF-κB信号通路的调控,NF-κB抑制蛋白(inhibitor ofnf-κB,IκB)等NF-κB通路中重要的蛋白因子均可被小泛素相关修饰物修饰,进而调控NF-κB信号通路。sumo化修饰酶在该调控中发挥极其重要的作用,其中sumo结合酶E2(即ubc9蛋白)和sumo连接酶E3成员之一的信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)抑制蛋白(protein inhibitor of activated STAT,PIAS)家族是近年来的研究热点。文中综述sumo化、sumo化修饰酶及其对糖尿病肾病NF-κb信号通路的调控作用。

巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。

SUMO化修饰对NF-κB信号通路的调控

小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)经由一系列酶介导的生化级联反应共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上,稳定靶蛋白免受降解的过程称为SUMO化修饰(SUMOylation)。核转录因子κB(nuclear factors κB,NF-κB)是公认的炎症和免疫反应的重要调节因子,并与糖尿病的发生发展密切相关。近年来研究发现,不仅NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)的SUMO化修饰参与NF-κB信号通路的调节,而且SUMO酶可以直接调节NF-κB对靶基因的转录。现就SUMO亚型及结构,SUMO化修饰与去SUMO化修饰过程,SUMO、SUMO酶对NF-κB的转录调控及其与糖尿病相关性的最新研究进展作以综述。

1例抗人SUMO1激活酶亚基1抗体阳性无肌病性皮肌炎的诊断过程

皮肌炎是一种主要累及皮肤和肌肉的特发性炎症性肌病,可分为有肌病性和无肌病性,可先有皮损,再有肌炎,皮损较为典型。只有皮损而没有肌炎表现的患者可依靠现代诊疗手段确诊,如肌炎抗体检测可帮助无肌病性皮肌炎患者更早明确诊断,结合患者的一般辅助检查,如胸部CT、心脏彩超、肌电图等协助诊断。该文介绍1例抗人SUMO1激活酶亚基1抗体阳性无肌病性皮肌炎患者的诊断过程。

SAE1与SAE2蛋白相互作用肽抑制剂的多种体外筛选体系的构建与评价

目的·构建用于发现小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)的活化酶亚基1(SUMO-activating enzyme subunit 1,SAE1)与亚基2(SUMO-activating enzyme subunit 2,SAE2)相互作用的肽抑制剂的多种体外筛选体系,并对不同筛选体系的优势与不足进行评价。方法·将编码SAE1和SAE2的目的基因分别插入pET-28a载体以构造原核蛋白表达质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化人源SAE1和SAE2蛋白;利用纯化的蛋白先后构建等温滴定量热检测(isothermal titration calorimetry,ITC)实验、荧光偏振(fluorescence polarization,FP)实验、表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)实验和基于SAE酶活的荧光实验等多种筛选体系。尝试利用不同的筛选体系检测候选多肽的抑制活性,基于检测结果,从灵敏度、稳定性、检测通量和检测成本等维度评价各筛选体系的优缺点与适用性。结果·经ITC测得SAE1和SAE2蛋白在体外相互作用的解离常数(K_(d))为0.96μmol/L,并将活性最好的多肽PEPT7改造为FP实验的示踪剂(tracer),但同SAE2的亲和力无法满足FP的要求;SPR测得SAE1和SAE2相互作用的K_(d)值为1.13μmol/L,与ITC数据接近;基于SAE酶活的荧光实验筛选得到抑制活性最强的多肽HP1B[半数抑制浓度(half-maximalinh ibitory concentration,IC_(50))达15.72μmol/L],SPR进一步确定其同SAE1的亲和力为34.4μmol/L。结论·尝试构建并比较了多种常见的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)抑制剂的筛选体系。其中,ITC的检测通量低,且难以准确评估结合热不显著的低亲和力多肽;FP体系的可行性高度依赖于示踪剂同靶点蛋白之间的强亲和力,同样无法用于低亲和力多肽的筛选与优化;SPR检测的灵敏度高,但检测成本较高;酶活实验兼具高灵敏度、稳健性、高通量和可接受的检测成本,是最适宜的筛选方法。

SUMO化修饰在心血管疾病中的研究进展

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)包括动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭和缺血性心肌病等,是由许多因素引起的常见疾病,发病率和死亡率较高,严重威胁人类健康。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-like modifier,SUMO)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式,也是一种动态可逆的修饰方式,因在真核生物中具有重要的生物学功能而被广泛报道。底物蛋白的赖氨酸残基可与SUMO分子共价结合发生SUMO化,从而调节底物蛋白的功能和细胞活性。大量研究表明,底物蛋白的SUMO化在心血管发育和功能中发挥着关键作用。在某些病理条件下,蛋白质的SUMO化会发生很大变化,是导致疾病的关键因素之一。外泌体作为细胞间通信的重要介质在心血管疾病中具有重要的靶向调控作用,而SUMO化修饰可以调控外泌体中内容物的分选机制。综上所述,本文对SUMO化修饰在心血管疾病中的研究进展以及SUMO化修饰联合外泌体在治疗心血管疾病中的应用予以综述,旨在为心血管疾病治疗提供新颖的策略。

LwaCas13a蛋白的表达纯化与活性分析

【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a;LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 mg/mL浓度的LwaCas13a蛋白。荧光检测结果显示,LwaCas13a蛋白具有明显的反式切割活性,为商业化Cas13a蛋白活性的1.25倍,且LwaCas13a蛋白与CrRNA的最佳结合比例为1∶2。【结论】试验成功表达纯化出高纯度、高浓度的LwaCas13a重组蛋白,其反式切割活性优于商业化Cas13a蛋白,并明确了该蛋白与CrRNA的最佳配比,为利用LwaCas13a进行动物病毒RNA检测新技术的研发提供了依据。

rhFGF-21的高效表达及其纯化工艺的优化

成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是FGF家族的一员。现有研究表明,FGF-21是一种血糖调节因子,有望被开发成为治疗糖尿病的候选药物。本实验是在前期研究的基础上,对高效表达FGF-21基因的工程菌株进行接种、发酵、诱导表达,将表达产物纯化,PEG修饰提高其体内半衰期,通过改变反应体系的反应时间、反应温度、蛋白浓度和反应物之间的质量比优化修饰反应。阴离子交换层析纯化反应混合物,最终得到纯度大于98%的活性FGF-21蛋白。