Surfactin的结构、生物合成及其在生物防治中的作用

Surfactin是由多种芽孢杆菌产生的一种脂肽,其由一个环七肽头基通过内脂键与链长12-17个碳原子的β-羟基脂肪酸连接组成,是一种非常有效的生物表面活性剂,并具有重要的生物学功能。本文介绍了surfactin家族的结构和生物合成模式,surfactin是由非核糖体肽合成酶催化合成,这种机制赋予了surfactin家族成员的结构多样性;综述了surfactin在植物病害生防中的作用及机制。已有的研究表明surfactin在生物防治中的作用机制主要有以下4种方式:(1)损伤病原菌细胞膜,引起细胞膜裂解或渗透压失衡;(2)抑制病原体繁殖;(3)诱导植株系统抗性;(4)促进生防菌株的定殖或生物膜的形成。进一步总结了利用基因工程技术研究surfactin的最新进展,以指导surfactin的生物合成及其新衍生物开发。Surfactin的高度结构多样性,使其具有丰富的物理化学特性,这些特性可以与多种生物活性联系在一起,将在不同的领域有更广泛应用。随着对surfactin生物合成研究的日益深入,将会有更多高性能和广阔应用前景的新型脂肽被研发,这为surfactin的进一步研究和生防应用提供依据。

枯草芽孢杆菌OKB105产生的surfactin防治烟草花叶病毒病及其机理研究

本文研究枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物表面活性素surfactin对烟草花叶病毒病的防治效果,并检测烟草防卫相关基因的表达情况以解析抗病机理。利用6 mol/L HCl沉淀枯草芽孢杆菌OKB105的去细胞培养液,通过甲醇抽提,Sephadex LH20层析柱获得脂肽纯化物。经MALDI-TOF-MS和血平板溶血试验检测表明,纯化物中仅含有表面活性素surfactin。将表面活性素配成0.01 g/L溶液,处理烟草并接种TMV。结果表明,surfactin对烟草花叶病毒病有显著的防治效果,病斑抑制率为70.9%。通过Real-time PCR检测烟草的防卫相关基因的表达情况结果发现,烟草SA信号通路的PR1、PR3和PR5,以及ET通路的ETR1表达量显著提高,说明surfactin诱导了烟草依赖于SA和ET信号通路的诱导系统抗性(induced systemic resistance,ISR)反应。

脂肽类生物表面活性剂Surfactin的乳化性

采用白金板法对Surfactin的表面活性进行研究,并用浊度法和离心法对其乳化性进行研究。结果表明：Surfactin的临界胶束浓度为9.03×10-5 mol/L,可将水的表面张力由73.98 m N/m降至最低27.48 m N/m。在浓度为1×10-3~1.2×10-2 mol/L的NaCl溶液中,Surfactin溶液的表面张力随盐浓度升高逐渐降低并最终稳定在34 m N/m;Surfactin在121℃处理20 min后,其表面张力仍能保持在37.10 m N/m;在pH值为2~12范围内,其表面活性稳定并良好;表明Surfactin具有较强的NaCl浓度、温度、pH值的耐受性。浊度法测得Surfactin亲水亲油平衡（hydrophile lipophilic balance,HLB）值为14,对所需HLB值为12~16的油相乳化性能良好。

脂肽surfactin、iturin、fengycin性质鉴定的研究与展望

脂肽是一类由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成的生物表面活性剂。相比化学表面活性剂,生物表面活性剂除具有降低表面张力,增加泡沫,稳定乳液等性质外,还具有安全,可降解的特性。一些脂肽还具有抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性,在日化、食品、制药、生物防治、微生物采油等方面都有良好的应用前景。surfactin,iturin,fengycin是一类主要由革兰氏阳性菌芽孢杆菌产生的常见脂肽,表面活性或抑菌活性均十分突出。目前对surfactin、iturin、fengycin的分子量、结构、性质的研究比较透彻,也相应开发出来一些鉴定方法。本文主要对常见脂肽surfactin、iturin、fengycin的性质,抑菌效果及主要的鉴定方法进行了介绍。

surfactin高产菌株的等离子体诱变及其高通量筛选

利用常压室温等离子体(atmospheric pressure and room temperature plasma,ARTP)方法对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis E7进行快速诱变,筛选表面活性素(surfactin)高产菌株。采用表观初筛,溶血圈初筛,孔板复筛,多功能酶标仪检测,摇瓶验证相结合的方法提高了筛选通量,加快了筛选进程,构建了高通量诱变筛选surfactin高产菌株的体系,并使用高效液相(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法对产物进行检测。优化处理时间为220 s,获得了遗传稳定的突变菌株Bacillus subtillus SF90-5,其产surfactin能力提高到约0.8 g/L,是原始菌株的5倍。ARTP诱变技术结合高通量筛选体系极大程度减少了工作量,提高了筛选通量,加快了筛选进度,并快速获得了目的菌株,为脂肽类表面活性剂进一步的工艺研究提供了基础。

氨基酸和碳架物质前体对surfactin生物合成的影响

本文研究了单独添加以及组合添加氨基酸和碳架物质对surfactin生物合成的影响。氨基酸筛选试验表明,赖氨酸和甘氨酸能在一定程度上提高surfactin产量。添加一定浓度的赖氨酸和亮氨酸时,surfactin的产量分别比对照提高了29.20%和23.58%。进一步采用空间填充试验设计研究了氨基酸协同作用对surfactin生物合成的影响。结果表明:组合添加试验各氨基酸之间无交互作用,而且对surfactin生物合成未表现出比单独添加更高的增强作用,因此推测其surfactin生物合成存在严密的特异性限速机制。对碳架物质的筛选试验发现,添加三羧酸循环(TCA循环)相关碳架柠檬酸钠、琥珀酸钠和草酸时surfactin生成系数(YP/X)均高于对照组。琥珀酸钠和草酸单独添加浓度为0.75 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,YP/X分别达到0.58和0.52。由于壬酸钠和癸酸钠的细胞毒性作用,碳架组合添加的均匀试验设计中对surfactin产量提高不明显,推测其surfactin生物合成途径与能量代谢存在潜在调控路径。

Surfactin抑制乳中大肠杆菌O157活性研究

本研究采用牛津杯法和倍比稀释法测定大肠杆菌O157对Surfactin(生物表面活性素)的敏感性,并通过检测对大肠杆菌O157生长曲线、杀菌率、杀菌动力学的影响探讨Surfactin对大肠杆菌O157的杀菌特点,最后测定了Surfactin对鲜乳中大肠杆菌O157的杀菌效果。结果表明,大肠杆菌O157对Surfactin敏感性较高,其最小抑菌浓度(MIC)为25μg/ml,Surfactin不仅具有抑制大肠杆菌O157的作用,还具有明显的杀菌效果。2MICSurfactin作用于鲜乳介质中的大肠杆菌48h后,大肠杆菌不被检出。

枯草芽孢杆菌B006产surfactin突变株特性及其对黄瓜枯萎病的抑制能力

为了明确surfactin产量不同的芽孢杆菌对黄瓜枯萎病的控制作用,本研究采用N+注入诱变共获得1250株芽孢杆菌B006的突变株,通过对黄单孢杆菌的抑菌试验筛选并获得3株产surfactin突变株B841、B73和B1020。对各突变株NB发酵液的HPLC ESI MS分析表明:突变株B841和B73的surfactin含量比野生菌株B006分别升高了15.9%和14.8%,而突变株B1020的surfactin含量比野生菌株降低了85.2%;各突变株fengycin产量未发生改变。对surfactin各组分的质谱图解析,发现突变株B841和B1020的surfactin组分发生变化,突变株B841的surfactin组分中无m/z为995的同系物,而突变株B1020的MS图谱中只发现了m/z为1037和1051的surfactin同系物;对突变株的生物学特性测定表明:突变株B73和B1020的菌落形态发生改变,生长周期缩短;3个突变株比野生菌株产芽孢能力下降,突变株B1020在含有玉米粉和豆饼粉的培养基上不产生芽孢。对各菌株添加到育苗基质中(浓度为106cfu·g 1)后,防治黄瓜枯萎病的效果测定表明:2周时,突变株B1020防效接近于野生菌株B006,达70%以上;但3周时,防效下降到36.2%;突变株B841防效始终低于野生菌株B006,只有29.1%。本研究发现芽孢杆菌B006及其突变株在NA培养液中的surfactin产量的高低与其在育苗基质中的防病效果无直接的相关性,对其在自然土中的防病效果值得进一步研究。

抗菌脂肽Surfactin的抗菌活性及应用

Surfactin是枯草芽孢杆菌属不同菌株代谢产生的一种抗菌脂肽,不仅能抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等病原菌,而且还具有抗病毒、抗支原体、抗原虫等活性,是潜在的抗生素理想替代品之一。本文对抗菌脂肽Surfactin的结构、理化性质、抗菌机制及应用研究进展进行了综述,为Surfactin的进一步研究和应用提供参考。

Surfactin对蜡样芽孢杆菌芽孢灭活作用途径研究

目的研究Surfactin对蜡样芽孢杆菌芽孢灭活机制。方法将不同浓度Surfactin和芽孢相互作用后,利用紫外分光光度计检测芽孢内大分子组分(如蛋白质、核酸等)的泄漏情况。结果研究发现300和450μg/mL的Surfactin处理后的菌悬液中可明显检测到核酸和蛋白质的泄露。随着时间的延长,加入Surfactin后可使其DNA紫外吸收光谱发生变化,导致DNA最大吸收峰发生红移现象,最初的最大吸收峰253.5 nm移至了257 nm,产生了明显的增色效应。流式细胞的结果说明在最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的情况下,芽孢的膜结构没有明显破损,核内遗传物质没有明显泄露,随着时间延长,泄漏明显;在2~3 MIC浓度的情况下,芽孢的膜结构有明显破损,核内遗传物质有明显泄露。结论Surfactin通过破坏芽孢壁的完整性、与DNA结合对蜡样芽孢杆菌芽孢发挥灭活效应。

Taguchi法优化Bacillus amyloliquefaciens fmb50产surfactin工业发酵培养基

采用田口方法(Taguchi method)对影响surfactin生产的各因素进行筛选,并对显著因子的水平进行优化后得出最佳配比。统计分析结果表明:玉米粉、硝酸铵和PO43-对其产量影响显著。获得高产工业发酵培养基的配方为:玉米粉35g/L,硝酸铵为15g/L,尿素6g/L,PO34-20mmol/L,Mn2+0.5mmol/L,Mg2+0.1mmol/L,Cu2+12.8μmol/L,Fe2+1μmol/L,Ca2+0.5μmol/L。此培养基surfactin产量达2294.28 mg/L,较原有Landy培养基产量提高15%,生产成本降低40%,为实现surfactin的工业化生产提供了基础。

抗菌脂肽surfactin对雏鸡生长性能及血液生化的影响

为研究饲料中添加surfactin对雏鸡生长性能和血液生化的影响,试验选取雏鸡100只,随机分成3、6、9 mg/kg surfactin、30 mg/kg金霉素和空白对照组,每组4个重复,每个重复5只,试验期鸡龄为21~50 d。结果表明:21~35 d内,3 mg/kg surfactin和6 mg/kg surfactin组,日平均增重比对照组分别增加23.9%(P<0.05)和24.7%(P<0.05),比金霉素组分别增加13.5%(P<0.05)和14.2%(P<0.05),35~50 d,3 mg/kg surfactin和6 mg/kg surfactin组,其日平均增重相对于空白对照组分别提升26.5%(P<0.05)和31.4%(P<0.05),与金霉素组比无显著性差异。试验期间,3 mg/kg surfactin和6 mg/kg surfactin组死亡率比对照组和金霉素组分别少15%和5%,3 mg/kg surfactin和6 mg/kg surfactin组的料肉比分别低于对照组4.5%(P<0.05)和5.1%(P<0.05),与金霉素组比无显著性差异。surfactin对雏鸡血清中总胆固醇、谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量的影响统计学上无显著差异,3、6 mg/kg surfactin和9 mg/kg surfactin组血清中甘油三酯和尿素氮的含量降低,甘油三酯含量分别降低19.2%(P<0.05)、12%(P<0.05)和68.6%(P<0.05),尿素氮含量分别降低36%(P>0.05)、69.7%(P<0.01)和67.4%(P<0.05),血清中白蛋白的含量提高,血清中白蛋白含量分别提升66.4%(P<0.05)、61.7%(P<0.05)、67.3%(P<0.05)。综上可得,surfactin能促进雏鸡生长,降低料肉比、死亡率和血清中甘油三酯和尿素氮含量,提升血清中白蛋白的含量,促进饲料中蛋白质的消化吸收,在日增重和死亡率及血液生化指标方面优于金霉素。

肉制品主要组分对Surfactin抑制蜡样芽孢杆菌芽孢效果的影响研究

高温杀菌后的肉制品在贮藏货架期中发生腐败变质,主要原因是由于其中残存少量芽孢导致的,为了最大限度保障肉制品的安全,探讨Surfactin对芽孢的灭活效果。研究肉制品不同组分对Surfactin抑制芽孢的影响,旨在为其科学使用奠定理论依据。通过设计肉制品中常见食品组分NaCl、蛋白质和脂肪的不同浓度,检测残存芽孢存活数量,评价不同浓度Surfactin对蜡样芽孢杆菌芽孢存活的抑制效果。研究结果表明,NaCl、牛血红蛋白、亚油酸对Surfactin灭活蜡样芽孢杆菌芽孢有不同程度的影响。在低浓度Surfactin时,低浓度NaCl(1%)有保护芽孢不被灭活效应,而高浓度NaCl(3%~9%)则有促进芽孢被灭活效应,显示出协同效应。而在高浓度Surfactin时,只有9%NaCl浓度显示出协同效应。蛋白质表现出一定程度的保护作用,脂肪只有在高浓度组(25%以上)才显示出对芽孢的保护效应。

高产Surfactin发酵培养基的筛选优化

Surfactin是芽孢杆菌属细菌发酵产生的抗菌脂肽,在化妆品、医药、食品、乳化剂、保湿剂、精细化工中有广泛的应用前景,然而其发酵产量低、分离纯化困难限制了应用。为筛选成本低廉,适合工业化生产的Surfactin发酵用培养基,以一株诱变的枯草芽孢杆菌525为发酵菌种,通过单因素试验研究碳源、氮源、无机盐的种类及pH对Surfactin产量的影响,再通过正交试验筛选最佳碳源、氮源及无机盐添加浓度。结果表明:最优培养基组成配方为蔗糖20 g、尿素10 g、硫酸镁2 g、氯化钾2 g、磷酸二氢钾2 g、硫酸铜0.64 mg、硫酸铁0.60 mg、硫酸锰20 mg、水1 L,在pH 7.2,37℃、摇床200 r/min条件进行发酵培养72 h,Surfactin产量达661.33 mg/L,比初始培养基提高82.6%,且重现性好,适合工业化生产。

Surfactin的生产和功能及其在食品工业中的应用展望

Surfactin是一种性能优良的生物表面活性剂。对Surfactin基本结构进行了简要介绍,并对其发酵生产中菌种、培养基优化、发酵工艺优化、防腐抗菌作用、表面活性性能、乳化与发泡性能进行了详细论述。根据其功能特性,对其在食品工业领域中的应用前景进行了展望。

发酵肠中一株细菌的16S rDNA鉴定及抗菌肽Surfactin对其芽孢灭活的效果

经过杀菌的发酵肠,仍有部分会变质,为探究其原因并进行控制而进行了以下试验。从商业发酵肠中分离获得1株耐热芽孢菌株B1,为构建控制技术,提高发酵肠安全水平,对该芽孢菌进行鉴定,并研究抗菌肽surfactin对其芽孢生长曲线的影响及盐类对surfactin灭活芽孢效果的影响。采用16S rDNA序列分析对该菌进行鉴定,并研究了不同浓度的Na Cl和Na_2HPO_4·12H_2O对surfactin灭活芽孢效果的影响。结果表明,该菌属蜡样芽孢杆菌属,同源性相似度达99%,仅有surfactin对芽孢作用时,不同浓度(20、25、30、35μg/mL)的surfactin对其芽孢没有显著的杀灭作用,与Na Cl和Na_2HPO_4·12H_2O协同作用时,3%、5%、9%的Na Cl可配合50μg/mL和100μg/mL的surfactin可有效杀灭芽孢,Na_2HPO_4·12H_2O无此效果。该菌属于蜡样芽孢杆菌属,Na Cl与surfactin共同作用可有效杀灭蜡样芽孢杆菌的芽孢,Na_2HPO_4·12H_2O无显著作用。

Bacillus subtilis 168菌株产surfactin改造

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株基因组中含有编码surfactin合成酶系的srfA操纵子,却不产抗菌肽surfactin。运用同源重组的方法将外源的有活性的sfp基因(编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)整合入B.subtilis 168中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌和解淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上、下游找出较为保守的区域,设计引物,从枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增sfp基因,将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连接于枯草整合质粒pDG1730上,最终构建了枯草芽孢杆菌整合质粒pST-1730,利用pST-1730本身的淀粉酶E基因与B.subtilis 168菌株的基因组DNA进行同源重组整合,获得了产surfactin的重组菌株B.subtilis121。本研究为surfactin合成酶基因的改造和分析奠定了基础。

Surfactin凝胶配方设计及其抑菌性能分析

为拓宽表面活性素Surfactin的应用范围,拟制备以卡波姆974p作为抑菌凝胶基质、Surfactin作为抑菌成分、三乙醇胺为中和剂的Surfactin抑菌凝胶。通过研究各成分对该抑菌凝胶的抑菌作用、pH值和黏度的影响,设计Box-Behnken响应面试验得到最佳配方,优化结果为Surfactin用量0.60%、卡波姆974p用量0.35%、三乙醇胺用量0.30%,此条件下得到的抑菌凝胶感官清亮,Surfactin性质更加稳定,有较强的瞬时杀菌活性,与溶液相比,对成熟的金黄色葡萄球菌生物膜的清除效果有显著提升,处理后的生物膜出现裂纹,颜色变浅透亮,分布稀疏,更容易被清除。

Surfactin作为表面活性剂对O/W型藻油DHA乳状液物理和氧化稳定性的影响

以Surfactin作为表面活性剂制备藻油二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)乳状液并研究其稳定性。研究发现,水相为质量分数0.8%的Surfactin溶液,在不添加助表面活性剂和其他添加剂的条件下,制备水包油型藻油DHA乳状液,在4℃和37℃条件下保存相比其他表面活性剂具有良好的物理稳定性,在浊度、粒径、Zeta电位和流变学角度与Tween-80-丙三醇等表面活性剂制备的藻油DHA乳状液相比均有显著差异(P<0.05),Surfactin藻油DHA乳状液在各方面均优于其他表面活性剂的藻油DHA乳状液。在高温处理和常温贮存过程中,Surfactin藻油DHA乳状液的氧化稳定性也十分优良,在37℃贮存60 d乳状液过氧化值始终处于较低水平,仅为(1.635±0.202)meq/kg。

Surfactin抑菌稳定性及其在米饭和面包中的应用

本文研究了温度、p H、紫外、糖、盐对Surfatin抑菌效果的影响以及其在米饭和面包中的初步应用。结果表明：在弱酸性条件下,Surfatin的抑菌活性随温度变化不大,p H6,100℃处理20 min,对藤黄微球菌的抑菌圈由17.52±0.22 mm变为16.44±0.03 mm;而在碱性条件下,高温处理使其严重失活,在p H8,60℃处理20 min,抑菌圈由15.75±0.19 mm减小到12.69±0.26 mm,且90℃便使其完全失活;紫外会降低Surfactin抑菌活性,但效果不明显;糖、盐对其抑菌效果无显著性影响;在p H大于5.5的食品中,防腐保鲜效果优于Nisin,在米饭中加入适量的Surfactin,可将保质期延长24 h,在面包中适宜添加量为200~500 mg/kg。