肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌的实验研究

目的:探讨肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌的疗效。方法:根据GenBank中Surivivin基因序列设计引物,在上下游引物5’端引入相应酶切位点,以Hep G2基因组DNA为模板扩增Surivivin启动子基因片段。体外合成最小polyA转录中止信号,以p SUPER.retro.puro载体为媒介构建新的干涉载体pS-surP-shRNA-mpA(p S/sur P),完成干涉靶点的选取并完成干涉载体的构建和鉴定;建立细胞培养和转染及稳定转染细胞系,完成FAK RNAi的干扰效应性检测,进行体外细胞增殖及凋亡实验。结果:重组质粒完成DNA提取后,PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳后获得1条预期大小的特异性皮带,质粒Surivivin启动子调控的FAK shRNA涉及符合要求。将目的片段与肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA慢性载体表达载体连接的阳性克隆序列,获得DNA序列证实含有目的序列片段,提示质粒构建成功;PCR仪结果显示:Surivivin启动子调控的FAK shRNA在肝癌细胞中表达水平较低,抑制率能达到73.33%;Western blotting法结果显示:转染后,与未转染的HepG2细胞相比,转染后肝癌细胞Surivivin含量明显下降;流式细胞仪结果表明:细胞转染后,肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA细胞凋亡率为24.39%,与未转染细胞的4.12%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌可明显抑制肿瘤细胞的增殖,控制肿瘤的侵袭与转移。

子宫内膜癌组织中细胞凋亡抑制蛋白surivivin的检测

目的 探讨细胞凋亡抑制蛋白Surivivin在子宫内膜癌组织中的表达情况。方法 采用免疫组化法对40例不同病理分型的子宫内膜癌组织中的$urivivin蛋白进行检测。结果 95％的子宫内膜癌组织中可检铡到Surivivin蛋白，特别是在Ⅱ期和Ⅲ期子宫内膜癌组织中均可以检出。结论 细胞凋亡抑制蛋白Starivivin参与子宫内膜癌的发生，井与其病理分型相关。

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。

Survivin对辐射损伤的影响及与caspase-9/6、3的关系

目的 观察survivin对辐射损伤的影响及与caspase 9 6、3的关系。方法 ①将IEC 6细胞放置于 2 %O2 环境中低氧 8h后 ,复氧 2 4、48h ,采用Western blot检测胞内survivin ;②给予不同实验组IEC 6细胞 3 5Gy6 0 Co辐射照射 ,采用细胞流式PI法检测细胞凋亡率 ,并使用荧光免疫检测试剂盒检测各组caspase 9 6、3活性。结果 低氧预处理方法可诱导IEC 6细胞表达survivin ,Survivin可明显降低辐射诱导的细胞凋亡率 (P <0 .0 1) ,其对caspase 9 6活性无明显影响 (P >0 0 5 ) ,可使caspase 3活性有明显下降 (P <0 .0 1)。结论 低氧预处理方法诱导的抗凋亡蛋白survivin是通过抑制caspase 3的活性 。

蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡过程中对Bcl-2、Survivin、Smac/DIABLO表达的影响

目的研究蟾蜍灵在诱导HL-60细胞凋亡过程中,对线粒体凋亡途径相关基因Bcl-2、 Bax、Survivin及Smac/DIABLO表达的影响。方法采用锥虫蓝拒染法检测细胞存活情况,细胞形态学观察及流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot分析Bcl-2、Bax、Smac/DIABLO、Survivin及caspase-3蛋白表达,RT-PCR检测Survivin mRNA表达。结果蟾蜍灵抑制HL-60细胞增殖,24,48及72 h的IC50 值分别为25．8,8．0及2．1 nmoL/L。蟾蜍灵大于50．0 nmol/L时可明显诱导HL-60细胞凋亡。50．0 nmol/L蟾蜍灵作用6,12,24及48 h,Bcl-2蛋白表达分别下调至作用前的88．6％,53．3％,19．2％及 9．5％,而Bax蛋白表达无明显变化,Bcl-2/Bax比值由2．0分别降至1．7,1．1,0．4及0．2。Survivin蛋白表达分别下调至作用前的75．2％,54．8％,37．5％及20．3％;Survivin mRNA表达在作用6,12和24 h 后分别下调至作用前的85．7％,39．4％和12．5％,在作用48 h后几乎检测不到。50．0 nmol/L蟾蜍灵作用12,24及48 h,线粒体部分的Smac/DIABLO蛋白表达分别下调至作用前的77．5％,21．2％及 15．3％,而胞浆部分的Smac/DIABLO蛋白表达分别上调至作用前的1．4,2．0．及3．5倍。蟾蜍灵作用 8-48 h可检测到caspase-3的活化亚基。结论蟾蜍灵诱导的HL-60细胞凋亡与Bcl-2及Survivin表达下调、线粒体释放Smac/DIABLO及caspase-3活化有关。

Caspase-3和Survivin在儿童皮肤血管瘤表达的意义

目的探讨Caspase-3和Survivin在儿童皮肤血管瘤不同时期的表达和意义。方法收集甘肃省人民医院病理科2000年1月-2005年12月手术切除皮肤血管瘤存档蜡块55例及手术切除正常皮肤标本8例,根据Mulliken标准进行病理诊断并分类,所有标本共分3组,其中增殖期组31例,退化期组24例及正常对照组8例。采用免疫组织化学SP法对2组血管瘤及正常皮肤组织中Caspase-3和Survivin进行染色,以正常血管上皮细胞或肿瘤细胞胞质和(或)胞核出现棕黄色颗粒为阳性,检测各组血管内皮细胞Caspase-3和Survivin的阳性表达情况。结果Caspase-3阳性表达率在增生期和消退期分别为35.5%和79.2%,消退期显著高于增生期(P=0.0459),增生期与正常皮肤组织表达无显著性差异(P=0.0573)。Survivin阳性表达率在增生期和消退期分别为77.4%和45.8%,增生期显著高于消退期(P=0.0085),消退期与正常皮肤组织表达无显著性差异(P=0.0593)。结论Caspase-3在儿童皮肤血管瘤消退期的高表达提示该基因可能在血管瘤消退期促进内皮细胞凋亡方面发挥作用,而Survivin在增殖期内皮细胞的高表达,提示其可能抑制了血管瘤内皮细胞的凋亡过程,Caspase-3和Surivivin参与了血管瘤中细胞凋亡的调节。