侵染甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）和甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因（hsp70）及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因（CP）基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引物筛选,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能同时检测SPCSV、SPVG和SPFMV 3种病毒的多重RT-PCR检测方法。该体系能有效扩增出大小为304、433、601 bp 3个特异性片段。测序结果表明3种病毒与参考序列的一致性达94%-99%。应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测单一或复合侵染3种甘薯病毒,为甘薯脱毒和病毒病诊断奠定基础。

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)ELISA鉴定及RT-PCR检测方法的建立

利用双抗体酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA ）对采自福建省51份甘薯叶片进行检测，结果显示51份样品中有24份SPFM V呈阳性，阳性率为47.06％，其中泉州样品SPFM V阳性率最高，为71.40％，其次为南安和龙岩的样品，阳性率均为50％。根据GenBank中公布的SPFM V外壳蛋白（CP）基因序列保守区域设计了1对特异性引物，通过RT-PCR反应程序的优化建立了能检测SPFM V的检测方法。该检测方法能够扩增出SPFM V特异性片段，片段大小为441 bp ，测序结果表明， SPFM V序列与参考序列的同源性92％～97％。

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种(系)叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附(NCM-ELISA)检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素(ubiquitin,UBI)和组蛋白(histone,H2B)编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种(系)的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种(系)的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型(WA)。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3—556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,提高检测灵敏度,实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物,采取单因素优化试验,对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg^(2+)、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化,恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析,SYBR Green I可视化显色,结果表明:SPFMV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.2μL、Betaine 7μL,64℃60 min。进一步利用SPFMV全基因组的4个片段(SPFMV-1、SPFMV-2、SPFMV-3、SPFMV-4)、SPCSV-Hsp 70和RGNNV进行特异性检验,分别建立了SPFMV和SPCSV的特异性RT-LAMP检测方法,扩增出了具有RT-LAMP的典型瀑布状条带,与凝胶电泳和SYBR Green I显色结果一致,SPFMV和SPCSV的灵敏度检测下限分别为:1×10^(-6)、1×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测灵敏度高,实现了结果的可视化。对田间甘薯苗和离体组织培养甘薯苗进行检测验证,SPFMV-RT-LAMP检测方法成功率为100%,SPCSV-RT-LAMP检测方法的成功率为95%,表明研发的SPFMV和SPCSV的RT-LAMP检测方法适用于SPFMV和SPCSV的快速检测。

甘薯羽状斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAMP特异性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同时设计2条反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特异性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分别设置F3/B3﹕FIP/BIP引物浓度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),d NTPs浓度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825mmol·L-1),Betaine浓度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反应温度(59、61、63、65、67和69℃)和反应时间(20、30、40、50、60、70、80和90 min),对RT-LAMP反应体系各条件进行优化,确定最佳反应体系。通过测序及酶切对RT-LAMP产物进行鉴定。以携带SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯叶片的总RNA为模板,分别进行RT-LAMP和RT-PCR特异性检测;带有SPFMV的甘薯总RNA进行10倍梯度稀释,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液为模板进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度测定。最后利用优化的RT-LAMP体系对山东省多地采集的SPFMV疑似病样进行检测,加入SYBR green I进行可视化检测。【结果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特异性检测方法,优化的反应体系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP为0.8μmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3为0.2μmol·L-1,d NTPs为0.325mmol·L-1,Betaine为1 mol·L-1;65℃反应70 min。特异性试验显示本研究建立的RT-LAMP只对携带SPFMV的RNA能够扩增出典型的梯状条带。RT-LAMP最低可检测的RNA浓度为121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能检测的RNA浓度为121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高10倍。田间样品检测,RT-LAMP扩增结果与可视化检测结果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用到SPFMV的田间检测。【结论】建立的RT-LAMP快速检测方法灵敏度高、特异性好,适用于SPFMV的田间快速检测。

甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用

根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单一RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法。该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型。灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL。该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具。

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

【目的】以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障。【方法】根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系。【结果】分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97%,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99%。分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象。以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致。【结论】用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测。

甘薯羽状斑驳病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针,经过对反应体系和反应条件的优化,建立了特异、灵敏、高效的SPFMV实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明:该方法能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.307和0.998,扩增效率为100.6%。最低可检测到约5.46个拷贝的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高2个数量级。建立的实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPFMV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒复合侵染甘薯引起的细胞病理学研究

2011～2012年在浙江杭州连续发现感病甘薯植株具有甘薯病毒病SPVD的典型症状,透射电镜观察发现其叶片包含有长度为600～900 nm,直径为12 nm的线状病毒粒子。使用特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,其病原为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)复合侵染。运用透射电镜研究SPVD引起的细胞病理学变化,观察到叶肉细胞的细胞质中含有马铃薯Y病毒属特征性柱状内含体,其结构分类为Ⅳ型;线状病毒样粒子以束状平行排列成聚集体的方式存在于细胞质中;叶绿体伸出伪足状结构包裹线粒体。在维管束细胞的筛管和伴胞中观察到弯曲线状病毒样粒子形成的聚集体,其粒子排列交错,与叶肉细胞中平行排列的病毒样粒子聚集体不同,符合毛形病毒属特征。另外还在维管束和叶肉细胞结合的部位发现复合侵染的细胞病理学特征。本研究表明危害甘薯生产的SPVD已扩散蔓延到浙江省。

甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)O株系中国分离物(SPFMV-O-Ch1)和RC株系中国分离物(SPFMV-RC-Ch1)的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10922和10851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10557和10482 nt组成,编码一个多聚蛋白,分别由3518和3493个氨基酸残基组成。两个分离物均在P1蛋白内编码一个P1N-PISPO蛋白,在P3蛋白内编码一个P3N-PIPO蛋白。基因组全序列核苷酸一致性分析表明,SPFMV-O-Ch1与SPFMV-RC-Ch1的一致性为87.3%,与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为86.0%—95.8%,与Ruk73分离物的一致性最高,为95.8%,与11-1分离物的一致性最低,为86.0%。SPFMV-RC-Ch1与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为85.9%—98.7%,与IS90分离物的一致性最高,为98.7%,与Aus1-2B分离物的一致性最低,为85.9%。基于多聚蛋白基因核苷酸序列的遗传进化树分析表明,SPFMV-O-Ch1与Ordinary、10-O和17-O等O株系的分离物形成一个分支,SPFMV-RC-Ch1与S、IS90和CW137等RC株系的分离物形成一个分支。重组分析结果表明,O-Ch1分离物中发现3个重组事件,分别发生在7731—9710、135—10012和4825—6948 nt,RC-Ch1没有发现重组事件。【结论】我国的SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分离物的基因组结构与其他分离物相同,O-Ch1与O株系分离物一致性较高,RC-Ch1与RC株系分离物一致性较高,O-Ch1分离物检测到3个重组事件,RC-Ch1未发现重组事件。

甘薯羽状斑驳病毒分子生物学研究概况

近些年来甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)分子生物学有了较深入的研究。如整个基因组的全序列、整个基因组作为一个可译框架 (ORF)的某些精细结构和特点、各个功能蛋白的结构和功能 (如蚜传机理 )、基因组组分与其它马铃薯Y病毒属 (PVY)成员的同源性比较、该病毒在PVY属病毒成员的分类地位等都有所涉及。了解这些为利用分子生物学手段对该种病毒进行鉴定、检测和加强抗SPFMV病毒基因工程的研究 。

甘薯羽状斑驳病毒cDNA探针的克隆及其应用

从表现病毒症状的甘薯叶片中直接提取甘薯羽状斑驳病毒(sweet Potato Feathery Mo-ttle Virus,SPFMV),用酚-SDS-蛋白酶 K 法提取 SPFMV RNA,以 Oligo(dT)作引物合成cDNA。以质粒 pUC19为载体,转化 E.coli DH5α,筛选出插入片段长度为1.9kb 的阳性克隆,以此制备探针,与 SPFMV(RC 株)感染的巴西牵牛(Ipomoca setosa)和牵牛(I.nil)叶片总核酸抽提液进行斑点杂交呈阳性反应。^(32)P 和生物素标记的 cDNA 探针杂交试验均得到理想结果。

高效价甘薯羽状斑驳病毒抗血清的制备

用嫁接方法将甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）接种到Ｉ．ｓｅｔｏｓａ上扩繁，以０．２ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２ＰＢＫ缓冲液、垫层差速离心、蔗糖密度梯度离心提取纯化ＳＰＦＭＶ。纯化的ＳＰＦＭＶＯＤ２６０／２８０的比值为１．２５。将纯化的ＳＰＦＭＶ免疫家兔制备抗血清，在环状沉淀和微量沉淀试验中，用提纯病毒测定抗血清的效价均为１：４０９６；以ＳＰＦＭＶ－ＩｇＧ为第一抗体，应用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ对甘薯和Ｉ．ｓｅｌｏｓａ叶片中的ＳＰＦＭＶ分别作了测定。

甘薯羽状斑驳病毒分离物的基因组3′-末端序列测定与分析

采用马铃薯Y病毒属通用引物,从甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)山东济南分离物和浙江杭州分离物基因组3′ 末端扩增到一个含1814个核苷酸的序列,序列号分别为AJ310201和AJ310202。两个序列均包括NIb基因部分序列(nts1 645)、外壳蛋白基因(nts646 1590)和3′ UTR(nts1594-1814),3′ 末端具有典型的poly(A)尾。外壳蛋白基因核苷酸系统进化树分析和氨基酸分析表明,以前对一些SPFMV分离物的命名有待商榷,一些相关性较强的分离物可分为3个进化主要群体,我国两个分离物属于第二群体。

应用免疫吸附电镜检测甘薯羽状斑驳病毒

应用血清学特异性的免疫吸附电镜法对接种ＳＰＦＭＶ的Ｉ．ｓｅｔｏｓａ、Ｉ．ｎｉｌ和网室种植的感染ＳＰＦＭＶ的徐薯－１８、新大紫甘薯叶片分别进行了测定．结果表明被检测的四种植物汁液的稀释度分别可达到１／１２８０、１／６４０、１／６４０和１／１６０；而用无血清包被的电镜铜网检测Ｉ．ｓｅｔｏｓａ、Ｉ．ｎｉｌ和徐薯－１８，其汁液稀释度仅达到１／２０．比较接种ＳＰＦＭＶ的Ｉ．ｓｅｔｏｓａ和Ｉ．ｎｉｌ植物体内病毒含量，前者高于后者．网室种植的自然感染ＳＰＦＭＶ的两种甘薯品种，体内病毒含量也不一样．

甘薯羽状斑驳病毒的分离与提纯

本文应用标准的甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)抗血清,通过两次蚜传,从徐薯—18、新大紫上得到一种病毒分离物。接种指示植物后这种分离物仅感染Ipomoea setosa、Ipomoea nil,不侵染Gomphrena globosa L.、Beta vulgaris L.、Nicotiana tabacum L.、Nicotiana glutionsa L.、Brassica pekinensis, Datura stramonium L.、Cucumis sativis L.、Brassica、juncea、Raphanus sativus、Phsalis floridana。此病毒分离物可用蚜传、摩擦接种、嫁接三种方式传播,稀释限点为10^(-5),体外存活期不到24小时,热灭活温度为60～65℃。蚜传这种分离物到 I·Setosa上,再嫁接到I. nil或I. setosa上扩大增殖,用0.2M pH7.2 PB^K进行粗提取,结合垫层超离心,最后经蔗糖密度梯度离心得到了高纯度的病毒的提纯物,OD260/280的比值为1.25,粒体长度主要集中在830～850nm之间。实验证明这种病毒分离物为甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)。病毒收量为64.3mg/kg感病组织。提纯病毒在电镜下任何视野都可见到多量的、密集成堆的病毒粒体。

甘薯羽状斑驳病毒中国分离株外壳蛋白基因的克隆和序列分析

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,以我们从国内甘薯品种徐薯-18上分离到的SPFMV的RNA为模板,经过反转录合成cDNA第一条链,经PCR扩增、限制性酶切后克隆于pUC19的Hind 和SacI位点,转化大肠杆菌JM109,经限制性酶切分析、PCR鉴定以及序列分析证实获得了SPFMV中国分离株外壳蛋白基因的全长克隆.

分泌抗甘薯羽状斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株构建及抗体初步应用

甘薯羽状斑驳病毒(Sweet Potato Feathery Mottle Virus,SPFMV),粒体条状,长800—850nm,不仅通过甘薯块根传播,而且被多种蚜虫非持久性传播,在世界甘薯产区均有发生,引起甘薯叶片明脉,脉带。褪绿斑及紫色羽状纹等症状,是我国甘薯产区的主要病毒之一。

分子标记辅助选育聚合烟草花叶病毒属病毒抗性基因(L^4)及马铃薯Y病毒抗性基因(Pvr4)的甜椒自交系

烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒是危害我国辣椒生产最重要的病毒之一,其中辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)近些年来危害日趋严重。L系列等位基因(L^1、L^2、L^3、L^4)是抗烟草花叶病毒属的主要抗性基因。为了提高辣椒品种烟草花叶病毒属病毒和马铃薯Y病毒(PVY)抗性,本试验分别以CM334(抗PVY,含Pvr4基因)和引进材料200375(抗PMMoV,含L~4基因)为抗源,以甜椒自交系83-163(中抗疫病和CMV)为回交亲本,进行多代回交并自交,利用分子标记辅助选择结合苗期抗病性鉴定、形态选择,最终选育获得了聚合烟草花叶病毒属病毒抗性基因L^4和马铃薯Y病毒抗性基因Pvr4的早熟、大果型甜椒自交系PT83-163(中抗疫病和CMV,携带抗病基因Pvr4和L^4),经人工接种鉴定表现抗病,其他园艺性状与自交系83-163相当。

四川省甘薯病毒的研究

利用指示植物巴西牵牛接种传毒试验及电镜负染检测,从我省表现斑驳花叶与明脉症状的甘薯病毒样品中,首次分离出甘薯羽状斑驳病毒。笔者采用5种病毒抗体(IgG)、两种血清学方法(DAS-ELISA和NCM-ELISA),对四川成都、绵阳、南充、内江等地的158份甘薯病毒样品进行了检测,结果表明,四川以上地区的甘薯普遍存在甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯潜隐病毒(SPLV)。应用脱毒苗露地栽培和小区产量对比试验证明,脱毒甘薯增产效果较稳定;笔者对甘薯茎尖脱毒及组织培养方法进行了探索。