甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3′端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。

甘薯潜隐病毒莲藕分离物辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒莲藕分离物sweet potato latent virus-lotus(SPLV-lotus)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR从感病莲藕样品中扩增获得SPLV-lotus辅助成分-蛋白酶基因(HC-Pro),大小为1375 bp。通过序列测定和分析后,将其克隆到原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导并纯化获得大小为74 kD的融合蛋白pGEX4T-1-HC-Pro^(SPLV-lotus)。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得过量表达。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清,采用ELISA和Western blot对抗血清效价和特异性进行检测,当HC-Pro抗血清稀释比为1∶256000时,ELISA显色后OD_(450)读数仍高于0.6,表明所制备抗血清合格;Western blot结果显示,在感染SPLV-lotus植株样品中仍能检测到单一目的条带。这些结果表明,制备的抗血清效价合格且可用于SPLV-lotus的特异性检测。

甘薯潜隐病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

甘薯是中国重要的旱地作物,具有天然的杂交优势,适应能力强且营养丰富,在中国广泛种植。在甘薯种植过程中,甘薯病毒的感染会导致甘薯产量与品质的下降,其中甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)是甘薯生产上常见的病毒之一,建立甘薯潜隐病毒的快速检测方法,对于该病的诊断及防御极其重要。根据NCBI数据库中甘薯潜隐病毒的全序列,选择保守性较强的外壳蛋白基因(cp基因),设计了一对全长引物与两对特异性引物。利用全长引物构建了甘薯潜隐病毒的阳性标准质粒,完成了特异性引物的筛选,并对其扩增条件进行了退火温度、循环数及引物浓度的优化。对该方法的灵敏度及特异性进行了检测,确定了甘薯潜隐病毒的RT-PCR检测技术体系。利用本体系对采集的15份疑似染病的甘薯样本进行检测,检测结果中有3份为甘薯潜隐病毒阳性。试验证明该检测方法具有很高的特异性与灵敏性,能够在甘薯脱毒薯苗生产中甘薯潜隐病毒的检测提供有力的技术支持。

3种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

病毒病是引起甘薯品质降低和减产的重要原因之一,现已报道30多种能侵染甘薯的病毒[1,2]。山东省是甘薯种植大省,病毒种类近10种[3,4]。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottlg vi一rus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latentvirus,sPLv)是为害甘薯的主要病毒,在全国甘薯种植区广泛分布[5,6]。甘薯病毒2(Sweet potatovirus 2,SPV2)为Potyvirus的一个暂定种,多与同属的其他病毒混合侵染[7]。

莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweet potato latent virus-lotus,SPLV-lotus)在江苏省莲藕产区普遍引起发病,并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况,针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R,通过优化引物浓度和退火温度条件,构建标准曲线,建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测技术。该方法特异性强,可以快速检测出SPLV-lotus,灵敏度为普通PCR的100倍,可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。

甘薯潜隐病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

以原核表达的甘薯潜隐病毒(SPLV)的外壳蛋白(CP)为抗原免疫小鼠,经过细胞融合和亚克隆,筛选出2株稳定分泌抗SPLV CP的单克隆抗体杂交瘤细胞株(5B11-2和5G8-2),并分别制备了单克隆抗体腹水。间接ELISA结果表明,用SPLV CP包被酶联板,5B11-2和5G8-2单克隆抗体的效价均为1∶512 000;用感染SPLV的甘薯叶片汁液包被酶联板,2株单克隆抗体的效价均为1∶6 400。抗体类型及亚类鉴定结果表明,2株单克隆抗体均为IgG1、κ轻链。Western blot分析表明,2株单抗均能与SPLV CP和感染SPLV的甘薯叶片汁液有特异性反应。利用单克隆抗体建立的间接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)检测SPLV方法,病叶1∶3 840倍稀释仍能检测到病毒。血清学和RT-PCR检测结果表明,制备的单克隆抗体可用于田间甘薯样品的检测。