甜味蛋白monellin高甜度、强热稳定性突变体的分子构建及性质研究

本文采用PCR技术对单链monellin(MNEI)进行定向突变,将构建好的重组质粒pET15b-MNEI双位点突变体转化到大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL中进行异源蛋白质的重组表达。通过镍柱亲和层析和分子筛收集纯化后的目的蛋白,使用蒸馏水在截留分子质量为3.5 ku的透析袋中进行蛋白透析,将透析得到的目的蛋白采用双盲法感官品评测定甜味阈值,蛋白突变体的二级结构和热稳定性采用圆二色谱仪测定。结果表明:成功构建了该蛋白3个双位点突变体E2M/E50N、E2Q/E50N及E2A/E50N,其中突变体E2Q/E50N成功表达与纯化。与野生型MNEI对照相比,测得的突变体E2Q/E50N的甜味阈值为0.64μg/mL,甜度提升近1倍;Tm值为78℃,热稳定性提高4℃。以上研究结果可为甜味蛋白monellin在食品、饮料和医药行业的生产与应用提供技术参考。

Monellin-EGFP融合蛋白在毕赤酵母中的表达

根据已报道的Monellin甜蛋白氨基酸序列,结合毕赤酵母与桑树密码子的偏好性,人工设计合成单链monellin基因,并与增强型绿色荧光蛋白EGFP基因连接,构建融合表达载体。采用电击转化法成功将表达载体导入毕赤酵母GS115中,并获得高效表达的重组子pPIC9K-M-E。经PCR检测,SDS-PAGE和Western Blot杂交证实已表达出融合蛋白,该蛋白经纯化与盲测实验,结果显示其甜度约为标准蔗糖的500倍。

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

在西非热带植物Dioscoreophyllum cumminsii中存在着一种由两条多肽构成的甜度极高的蛋白Monellin。本研究根据已知的Monellin晶体衍射分析结果和毕赤酵母(Pichia pastoris)基因偏爱密码子设计并合成了连接两条多肽的重组基因,插入到毕赤酵母分泌表达质粒pGAPZαA中。扩增后,电击穿孔转化毕赤酵母GS115,筛选高产菌株放大培养。以5升罐发酵培养,表达量为150mg/L。经纯化,可以获得大于130mg/L的具有高甜度的活性蛋白。

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M。通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性。

甜味蛋白Monellin及其基因工程

甜味蛋白monellin是一种高甜度、低热量的天然植物甜味蛋白,因其本身不含糖分,未来有望成为肥胖症、糖尿病和龋齿病等与糖的摄入有关的流行病患者的甜味替代品。但由于其生产成本高、热稳定性低等原因限制了其的大规模工业化生产,因此现阶段研究以实验室研究为主。文章综述了其来源特性、影响蛋白稳定性因素、甜味决定因素,并对其在基因工程方面的研究进展进行了综述。

重组甜味蛋白Monellin在E.coli中的表达条件及其对ICR小鼠血糖的影响

实验探究了重组Monellin菌株的最佳培养条件,并对其进行了甜味阈值确认和血糖值影响实验。实验所用菌种为实验室构建保存的BL21(DE3)-pET28a Monellin菌种,利用不同浓度的乳糖和IPTG诱导该菌种生成目的蛋白,探究其最佳诱导条件,利用镍柱亲和层析纯化目的蛋白后进行相对甜度和甜味阈值实验,随后设置甜度梯度,对小鼠进行灌胃比较蔗糖和Monellin的升血糖作用及不同浓度Monellin对血糖的影响。实验结果表明,0.9 mmol/L IPTG诱导5 h的Monellin表达量最多,其甜味阈值为100μg/mL,相对甜度为蔗糖的800倍。灌胃结果表明,Monellin升血糖作用不显著,并且在一定范围内对血糖的影响不随其浓度的改变而发生变化。该实验为Monellin在糖尿病等代糖食品市场上的应用提供了科学的理论依据。

甜蛋白大肠杆菌工程菌株发酵条件的优化及重组蛋白纯化方法的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3)。得到重组工程菌株BLC01。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50ml/250ml三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至浓度为0.9mM,32℃诱导5h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的45.2%。超声破碎细胞后,利用热处理和酸处理结合的方法有效去除宿主蛋白,透析后利用Sephadex G- 50进行柱层析,得到纯化重组甜蛋白monellin。monellin基因在重组大肠杆菌中的表达产物具有生物活性。

甜蛋白的研究进展

自 2 0世纪 6 0年代 ,人们陆续从热带植物中发现了 6种甜蛋白 (嗦吗甜、莫奈林、马槟榔、Brazzein、Pentadin、Curculin)和一种变味蛋白 (Miraculin) ,它们具有的高甜度或变味特性引起了人们的极大兴趣。本论文对这类蛋白的性质、氨基酸序列、结构作一介绍 。