Antibiotic Sensitivity Test and Detection of Sulfonamide Resistance Gene Sul2 in Escherichia coli Isolates from Swine

[ Objective] This study aimed to analyze antibiotic sensitivity and detect sulfonamide resistance gene Sul2 in 17 Escherichia coli isolates from swine. [ Method] The antibiotic sensitivity of 17 E. coil isolates from swine was analyzed with Kirby-Bauer disk diffusion method. Sulfonamide resistance gene Sul2 was detected by PCR amplification with the extracted genomic DNA as a template. [ Result] The 17 swine-derived E. coli isolates from different regions were resistant to various antibiotics and exhibited different multi-antibiotic resistance phenotypes, including nine isolates resistant to sulfamethoxazole, seven isolates resistant to oxacillin, ten isolates resistant to cefazolin and eight isolates resistant to erythromycin. Sulfonamide resistance gene Sul2 was successfully amplified from genomic DNA of E. coli isolates. The PCR results were basically consistent with antibiotic resistance phenotypes of these strains. [ Conclusion] Sul2 gene was widespread in swine-derived E. coli, which was closely associated with sulfonamide resistance phenotvpes of E. coli.

猪FUT2基因沉默对其所在通路基因表达及小肠上皮细胞E.coliF18黏附能力的影响

旨在细胞水平上进一步探讨FUT2基因的功能及其在猪小肠上皮细胞受到F18大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)侵染时的调控机制,为提高仔猪对F18大肠杆菌病抵抗力的分子选育提供理论基础。运用Real-time PCR方法检测分析FUT2基因在大肠杆菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)诱导小肠上皮细胞前后的mRNA表达差异,并采用Western blotting方法检测大肠杆菌F18ab、F18ac感染小肠上皮细胞前后FUT2的蛋白表达差异;同时设计并构建猪FUT2基因慢病毒干扰载体,筛选并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系,检测FUT2基因沉默对其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因(FUT1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表达以及小肠上皮细胞E.coli F18黏附能力的影响。结果表明,在F18大肠杆菌感染和LPS诱导小肠上皮细胞后,FUT2基因的mRNA相对表达水平均极显著升高(P<0.01),同时大肠杆菌感染后小肠上皮细胞的FUT2蛋白表达上升。此外,本研究成功构建FUT2基因慢病毒干扰载体,并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系;FUT2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因的表达都存在不同程度的下降,其中FUT1基因表达水平显著下调(P<0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表达水平极显著下调(P<0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表达水平未发生显著变化,同时FUT2基因沉默后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附能力显著降低。结果显示,FUT2基因低表达可能不利于仔猪大肠杆菌受体的形成,以增强猪小肠上皮细胞抵抗E.coli F18感染的能力,本试验结果同时为球系列鞘糖脂生物合成通路在仔猪抗大肠杆菌感染过程中的作用机制研究提供一定的理论基础和依据。

肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染的保护作用

为评价中药肠炎宁对猪大肠杆菌感染小鼠肠道的保护效果,并初步研究其机制,本试验将SPF级BALB/c小鼠随机分为空白对照组、大肠杆菌K88组和肠炎宁组3个组,大肠杆菌K88组和肠炎宁组小鼠通过口服产肠毒素性大肠杆菌K88诱导腹泻模型,12 h后分别灌服生理盐水和肠炎宁药液,连续给药3 d,检测不同组别小鼠的存活时间、体重变化、肠道病理变化、结肠长度变化、肠道通透性和炎症因子等指标变化,并分析炎症因子信号通路蛋白表达情况。结果显示,与空白对照组相比,大肠杆菌K88组小鼠出现死亡,存活时间显著缩短(P<0.05),体重显著下降(P<0.05),结肠显著缩短(P<0.05),肠道通透性和血清髓过氧化物酶(MPO)活性显著升高(P<0.05),血清和结肠组织中TNF-α和IL-1β水平显著升高(P<0.05);与大肠杆菌K88组相比,肠炎宁组小鼠存活时间显著延长(P<0.05),体重显著增加(P<0.05),结肠显著增长(P<0.05),肠道通透性和血清MPO活性显著下降(P<0.05),血清和结肠组织中TNF-α和IL-1β水平显著下降(P<0.05);组织病理学观察结果显示,肠炎宁可缓解大肠杆菌K88感染导致的结肠杯状细胞肿大和炎性细胞浸润;免疫组化结果显示,肠炎宁可抑制大肠杆菌K88导致肠道组织中iNOS和TLR4的上调。结果表明,肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染具有良好的治疗作用,本试验结果为肠炎宁应用于兽医临床提供了数据支持。

一株仔猪产肠毒素大肠杆菌分离鉴定、耐药性分析及其卵黄抗体的制备

为诊断某规模化养猪场仔猪腹泻病原,并制备其特异性卵黄抗体,采用细菌分离培养、生化试验、16SrRNA PCR鉴定及系统进化树分析、药敏试验等方法对病料进行研究,并利用全菌体灭活和超声波破碎法制备抗原,将其分别与不同佐剂(ISA 71VG、ISA201VG和15AVG)配伍乳化制备疫苗免疫蛋鸡、聚乙二醇法提取高免卵黄抗体、SDS-PAGE电泳和Bradford法鉴定抗体质量及浓度、双向琼脂扩散试验测定抗体效价。结果表明,分离菌株的形状、大小及生化特性均与大肠杆菌相符。分离株的主要毒力基因E.coli-estb和elt基因分别为113、272 bp;分离株elt和estb基因与美国流行毒株如UMNK88处于同一分支,亲缘关系较近;与丹麦株CFSAN018748、瑞士株14OD0056处于不同分支,亲缘关系较远。分离菌株对头孢噻肟、诺氟沙星和复方新诺明敏感,对头孢曲松和多黏菌素B中介,对多西环素、呋喃唑酮以及多种氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物耐药。各组卵黄抗体的重链(约70 ku)和轻链(约25 ku)均明显,纯度高。首免后56 d 0.2%甲醛处理的菌液与ISA 15AVG配伍所致疫苗的卵黄抗体蛋白含量最高(1.462 mg/g卵黄),超声波破碎处理的菌液与ISA 71VG配合所制疫苗的卵黄抗体蛋白含量次之(1.459 mg/g卵黄)。血清抗体与菌体抗原反应性良好,超声波破碎抗原与ISA 71VG配伍所制疫苗的血清抗体、卵黄抗体效价分别高达1∶16、1∶4。

利用PCR法鉴定产SLT-IIe大肠杆菌

类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体（ Ｓｈｉｇａｌｉｋｅ Ｔｏｘｉｎ Ⅱ Ｖａｒｉａｎｔ， Ｓ Ｌ ＴⅡｖ ｏｒ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ），是仔猪水肿病的主要致病因子。根据 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 基因序列，合成一对针对 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 操纵子基因保守区的寡核苷酸引物，建立了聚合酶链式反应（ Ｐ Ｃ Ｒ）扩增方法。通过对产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 毒素大肠杆菌菌株 Ｔ Ｂ１、产 Ｓ Ｌ ＴⅡ毒素大肠杆菌菌株 ９３３ Ｗ 和产 Ｓ Ｌ ＴⅠ毒素大肠杆菌菌株 Ｈ３０ 的试验，结果表明用所设计的引物建立的 Ｐ Ｃ Ｒ方法可特异性鉴定产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 大肠杆菌。用此法对本实验室从患水肿病仔猪肠道分离的 １５ 株大肠杆菌进行了鉴定，结果可从 １５ 个菌株的 １２ 株中扩增到 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 的特异性保守序列基因片段，而其它菌株未见此保守序列的基因片段。

辽宁地区猪源大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测与分析

为了解辽宁地区猪源大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药情况,采用K-B纸片法对65株猪源大肠埃希菌菌株进行6种氨基糖苷类抗生素的药敏试验,同时采用PCR方法对耐药菌株rpsl基因和4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aad A、aac(6')-Ⅰb-cr、aac C4进行检测及序列分析,并将阳性样品与Gen Bank中登录的序列进行同源性比较。结果显示,辽宁地区猪源大肠埃希菌对链霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素的耐药率分别为26.2%、15.4%、18.5%、29.2%、4.6%、21.5%;23株耐药菌株rpsl基因检出率为100%;4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aad A、aac(6')-Ⅰb-cr、aac C4检出率分别为13.0%、8.7%、69.6%、4.3%。以上结果表明,在氨基糖苷类抗生素中耐药性最低的是丁胺卡那霉素,rpsl基因及氨基糖苷类钝化酶基因普遍存在于辽宁地区猪源大肠埃希菌中。

猪α干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定

目的构建稳定、高效表达的重组猪α干扰素(rpoIFN-α)大肠杆菌表达菌株,并纯化鉴定该菌株表达的目的蛋白,进行生物学活性检测。方法提取猪肝脏细胞基因组DNA,PCR扩增猪α干扰素(poIFN-α)基因,克隆到pMD18-T载体上,测序鉴定后再亚克隆到pGEX-5X-1载体上,转化入E.coliBL21中后得到表达菌株,用IPTG诱导表达,收集的菌体超声破碎后取上清得粗制蛋白,用GST亲和层析法进行纯化,产物用Western blot进行鉴定,并在Hep-2/VSV系统上滴定效价。结果重组质粒pGEX-5X-1/poIFN-α经过EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切后可见501bp的目的片段,提取质粒测序鉴定,结果与GeneBank中的序列一致。转化入E.coliBL21中32℃条件下经IPTG诱导5h,提取总蛋白,SDS-PAGE检测显示带有GST标记的rpoIFN-α能高效表达,分子量约45ku,可溶性rpoIFN-α约占菌体蛋白的0.35,Western-blot鉴定显示有特异性条带。效价滴定结果表明该rpoIFN-α具有抗病毒活性,纯化后效价为7.5×106IU/ml,比活性达到1.1×107IU/mg。结论成功克隆了poIFN-α基因,并可在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的rpoIFN-α。

四川省不同地区猪源大肠杆菌耐药性调查

[目的]了解四川省不同地区猪源大肠杆菌的耐药性。[方法]采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法,对分离自四川各地不同养猪场的232株大肠杆菌对32种抗菌药物的耐药性进行调查。[结果]232株大肠杆菌除对头孢噻呋、头孢唑啉、头孢曲松和阿米卡星较敏感(耐药率≤15.52%)外,对其余28种药物均表现出不同程度的耐药性(耐药率范围42%～97%);98.7%的菌株表现出多重耐药性;对部分药物,分离自规模化养殖场菌株的耐药性比分离自散养户的菌株严重。[结论]分离菌株对大部分抗菌药物均表现出耐药性。

8种中药对猪源大肠杆菌的体外抑菌效果

为筛选出抗猪源大肠杆菌的中药,选取板蓝根、五倍子、鱼腥草、穿心莲、黄连、黄芩、连翘和金银花等8种中药进行煎液(相当于1g/mL生药),采用纸片法和牛津杯法测定中药对猪源大肠杆菌的体外抗菌活性,对具抑菌作用的中药采用试管二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果表明:板蓝根、五倍子、穿心莲、黄连和黄芩等5种中药对猪源大肠杆菌(TXH11-1)具抑制作用,五倍子的作用最强,对3株菌(TXH11-1、TXH5-2和MAZW7-3)的MIC均为31.25 mg/mL,MBC为62.50~125.00mg/mL;其次是黄连,平均MIC、MBC分别为62.50mg/mL和208.33mg/mL;穿心莲平均MIC为104.17mg/mL,MBC为125.00~500.00 mg/mL;黄芩抑菌效果稍弱,平均MIC为208.33 mg/mL,仅对TXH11-1和MAZW7-3有杀菌作用,MBC≥250.00mg/mL;板蓝根的作用最弱,仅对TXH11-1和TXH5-2具抑制作用,MIC≥250.00mg/mL,对TXH11-1有杀菌作用,MBC为500.00mg/mL;金银花、连翘和鱼腥草对3株试验菌均无抑制作用。

猪源大肠埃希氏菌对较新的16种抗生素的敏感性

对从北京某猪场分离的 2 0株猪源大肠埃希氏菌所做的对 1 6种较新抗生素的药敏试验结果表明 ,除对头孢三嗪 ( CRO)、头孢噻甲羧肟 ( CAZ)、头孢噻肟 ( CTX)未产生耐药性外 ,分离菌株对其余 1 3种药物均显示程度不同的耐药。多西环 ( DO)、乙酰螺旋霉素 ( ASP)、杆菌肽 ( B)、新生霉素 ( NB)、氯洁霉素对其无抑制作用。 2 0株耐药菌株中 ,有 1 5种耐药谱型 ,多数为

辽宁猪源大肠埃希菌的分离鉴定与药敏试验

为了调查辽宁省不同地区猪源大肠杆菌病的流行和耐药情况,无菌采集临床疑似大肠杆菌病病死猪或患病猪病料65份,经细菌分离培养及生化试验,共分离到65株大肠埃希菌,分离率为100%。对分离到的菌株进行药物敏感试验及超广谱β内酰胺酶(ESBLs)筛选和确证试验,结果显示,辽宁地区分离株均表现出不同程度的耐药,耐药菌株占98.46%,其中对四环素、青霉素及氨苄西林的耐药率分别为93.33%、81.54%和80.00%;对甲氧苄啶、磺胺异恶唑、氯霉素、恩诺沙星耐药性较高,分别为74.29%、74.29%、69.23%和68.57%;对米诺霉素及多粘菌素B较为敏感,耐药率仅为10%和9.23%;分离株多药耐药率较高,达92.31%。ESBLs确证试验结果发现,辽宁省分离株中29.23%的菌株能产生ESBLs。说明辽宁地区猪大肠埃希菌流行情况较为广泛,耐药情况较为严重。

猪和野生动物源大肠杆菌及沙门菌中磺胺类药物耐药基因的检测

对从四川省10个规模化猪场和16种野生动物的粪样中分离鉴定出的67株大肠杆菌、57株沙门菌进行了药敏试验。结果,猪源和野生动物源分离菌对磺胺类药物的耐药率分别为72.0%(72/100)和29.2%(7/24)。根据GenBank中登录的序列,设计了3对特异性引物,对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了三重PCR检测。在这124株细菌中,Sul1基因的检出率最高,为47.6%(59/124),Sul2基因的检出率为17.7%(22/124),Sul3基因的检出率为18.5%(23/124)。药敏试验结果与基因检测结果的符合率为89.9%。

规模化养殖场大肠杆菌的分离鉴定与耐药性监测

从武汉郊区规模化养殖场采集腹泻仔猪的棉拭子和病死动物的泄殖腔分泌物或肝脏,分离鉴定出致病性大肠杆菌73株,分离率为100%。采用K-B法对分离菌株进行体外药物敏感试验,根据CLSI2006标准判定结果。结果显示,猪源性大肠杆菌仅仅对阿米卡星和大部分头孢类抗菌药物的耐药率较低,对多数抗菌药物均表现为较高的耐药率,并呈现出严重的多重耐药现象,主要表现为7重耐药、8重耐药、9重耐药和10重耐药;禽源性大肠杆菌对头孢类、氨基糖苷类和硝基呋喃类抗菌药物的耐药率<30%,其他的均>75%,多重耐药主要表现为6重耐药,总体看来,其耐药性较猪源性大肠杆菌轻微。

20种中草药水提物的体外抑菌实验

[目的]筛选抑菌活性强的中草药,为临床用药、开发中草药制剂提供依据。[方法]采用水煎法制备20种中草药水提物,对猪链球菌和猪大肠杆菌进行体外抑菌试验,试管两倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)。[结果]20种中草药水提物对猪链球菌均有一定的抑菌作用,部分水提物对猪大肠杆菌有抑菌作用。秦皮水提物和马齿苋水提物对猪大肠杆菌均有较好的抑菌效果,MIC为125 mg/ml;其次是连翘水提物、石榴皮水提物,MIC为250 mg/ml。蒲公英水提物对猪链球菌的抑菌效果最好,MIC为62.5 mg/ml;其次是石榴皮水提物、黄柏水提物,MIC为125 mg/ml。[结论]20种中草药水提物对猪链球菌的抑菌效果明显好于对猪大肠杆菌。

三峡库区猪致病性大肠杆菌分离鉴定及药敏试验

从三峡库区10个区的猪场采集仔猪腹泻粪便等病料112份,经过细菌分离和生化鉴定分离到82株猪源性大肠杆菌,其中75株为致病性大肠杆菌。对82株猪大肠杆菌进行了15种抗生素敏感性试验,结果发现,分离菌株对15种抗菌药物均有不同程度的耐药。

辽宁地区猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检测与分析

为了解辽宁地区猪源大肠埃希菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因(PMQR)的分布及DNA解旋酶基因(gyrA、gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ基因(parC、parE)等编码的喹诺酮耐药决定区突变特征,以及这些基因突变对喹诺酮类抗生素耐药性的影响,采用PCR方法对23株喹诺酮类耐药菌株进行gyrA、gyrB、parC、parE、aac(6')-Ib-cr、qep A、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS等11个基因的检测与序列分析,并分析其耐药谱。结果表明,23株喹诺酮类耐药菌株耐药谱广,均对萘啶酸耐药;PMQR基因的阳性率为86.96%(20/23),其中5株携带3种PMQR基因,9株携带2种PMQR基因,6株携带1种PMQR基因,aac(6')-Ib-cr的阳性率最高,qep A、qnrB、qnrC和qnrS阳性率次之,qnrA、qnrD基因未被检测到;在对15株耐药菌株gyr基因和par基因编码的喹诺酮类耐药决定区的突变分析中发现,K447E的突变率最高,其次为D87N、D426N、S80I和A56T。由此可见,在辽宁地区PMQR基因及靶位突变成为猪源大肠埃希菌对喹诺酮类药物产生耐药性的重要原因。

生物除臭剂对猪粪大肠杆菌和葡萄球菌含量的影响

为了对生物除臭剂的除臭机理进行初步研究,试验将制备的生物除臭剂接种新鲜猪粪,采用实时定量PCR技术(real-time PCR)测定了不同发酵时间猪粪中大肠杆菌和葡萄球菌的含量。结果表明,制备的生物除臭剂对发酵猪粪中大肠杆菌和葡萄球菌均有一定的抑制作用,且持续时间较长。这些研究结果为微生态制剂除臭机理的初步研究提供了一定依据。

天津地区猪源大肠杆菌对抗菌药物敏感性测定

对从天津市各区主要养猪场分离的48株猪大肠杆菌进行了抗菌药物敏感性监测,结果表明,17种抗菌药物中抑菌作用最强的是头孢氨苄,敏感菌株为83.4%,其次是阿米卡星,敏感菌株为72.9%;对青霉素的耐药性为100%,其次是四环素,耐药性为85.4%。全部受检菌株均表现出不同程度的耐药性,多数为5耐以上多重联合耐药。其中12耐菌株所占比例最大(16.7%),其次为11耐菌株(14.6%)。48株耐药菌中,共有40种耐药谱型。

我国南方猪高热病的研究(Ⅰ)——大肠杆菌的分离、鉴定和致病性测定

从湖南3个高热病发病猪场11头病死猪的病料组织中均分离出了大肠杆菌，经血清学鉴定，鞭毛抗原（K88、K99、987P和F41）全为阴性反应。经过157种菌体抗原血清学检测，血清型为5、6、15、22、32和83型。药物敏感试验结果表明，分离的大肠杆菌对大多数常用药物耐药，对氟喹诺酮和头孢类药物敏感。将其中4头猪原代分离的大肠菌培养物以原倍（2×10^7个／mL）、10^4和10^8稀释的菌液分别感染18—22g小白鼠，原倍菌液感染的小白鼠12／30在感染后24h内出现死亡，而10^4和10^8稀释菌液感染的小白鼠均健活；将未经除菌的病死猪组织悬液、过滤除菌的组织悬液、大肠杆菌、过滤除菌的组织悬液及大肠杆菌分别感染30日龄左右的健康小猪，除未经除菌的组织悬液感染猪3／3发病，2／3死亡外，其余所有感染猪只出现体温升高，升幅达1～2℃，减食，精神萎靡，但没有死亡；将死亡猪再次分离到的大肠杆菌感染小白鼠和猪，小白鼠12／15出现死亡，感染猪只出现体温升高（超过1℃），没有出现死亡。结果证明：大肠杆菌在高热病的发病过程中只起协同诱发作用，引起猪发病死亡的真正原因可能是病毒感染。

辽宁地区猪源大肠埃希菌整合子携带情况调查与分析

查明辽宁地区整合子在猪源大肠埃希菌中的分布及整合子携带耐药基因盒的种类,可为该病的综合防控提供科学依据。本研究利用整合酶基因PCR扩增法检测整合子,并对整合子可变区进行扩增测序。结果表明,71.43%(40/56)的菌株为Ⅰ类整合子阳性,1.79%(1/56)的菌株同时为Ⅰ类和Ⅱ类整合子阳性,未检测到Ⅲ类整合子;87.8%(36/41)的菌株表现为Ⅰ类整合子可变区扩增阳性,扩增产物大小在116bp^2 307bp之间,100%(1/1)菌株表现为Ⅱ类整合子可变区扩增阳性,大小为2 106bp;整合子可变区含有编码对氨基糖苷类抗生素耐药的基因(aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、aacA4和sat2),编码对磺胺类抗生素耐药的基因(dfrA1、dfrA12、dfrA17),编码对氯霉素抗生素耐药的基因(cmlA1、cmlA6)。因此,整合子在大肠埃希菌中广泛存在,辽宁地区大肠埃希菌中整合子主要携带编码对氨基糖苷类、磺胺类和氯霉素耐药基因盒。