猪戊型肝炎病毒结构蛋白片段的表达及其在ELISA中的初步应用

为建立一种快速的猪戊型肝炎病毒抗体检测方法,根据已克隆的戊型肝炎病毒株DQ1结构蛋白基因(ORF2)的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计一对引物,上游引物和下游引物分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,用PCR方法扩增,获得369 bp大小的相应片段,位于ORF2 128-497 bp处。将扩增片段克隆到pET-32a构建了原核表达载体pET32a-DQ01,经测序证明该片段正确插入。将pET32a-DQ01转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白大小为33 ku,Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物活性,将表达蛋白作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立了ELISA诊断方法。

猪戊型肝炎ELISA诊断试剂盒的研制及应用

本试验旨在建立有效的针对猪戊型肝炎病毒(HEV)的诊断技术及试剂盒。作者建立了应用猪HEVORF3筛选出来的一段序列合成肽swHEV11检测HEV血清抗体的间接ELISA诊断方法,确定的抗原最适包被浓度为3μg·mL-1;血清最适稀释度为1∶10,作用时间为30min;酶标抗体最适稀释度为1∶12000,作用时间为60min。用HEV ORF3合成肽swHEV11研制的猪HEV ELISA诊断试剂盒,与北京万泰试剂盒检测比较,符合率为73.4%(205/279),灵敏度和特异性分别为73.3%(200/273)和83.3%(5/6)。该试剂盒批内重复的变异系数<10%,批间变异系数<20%。结果表明,该方法的建立和所研制的猪戊型肝炎诊断试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性合格,为猪戊型肝炎病毒抗体的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法。

河南地区猪戊型肝炎病毒的检测及基因序列分析

对从河南省郑州、洛阳、新乡、焦作、周口等5地市采集的133份血清样品进行戊型肝炎病毒(Hepatitis EVirus,HEV)IgG抗体分析;通过反转录聚合酶链式反应的方法(RT-PCR)对从郑州、中牟、新郑、济源、濮阳等5个地市采集的200份粪便样品进行HEV RNA检测.检测结果表明,79.70%的血清为HEV抗体阳性;7.5%的粪便样品为HEV RNA阳性.通过序列分析证明,3个测序的HEV河南分离株均为基因Ⅳ型.为了进一步研究河南HEV的特点,克隆得到筛选的地理株JY40病毒株基因组3’端826 bp的DNA片段,序列分析结果显示该片段与湖北株相应序列的同源性最高.

北京市售猪肝脏戊型肝炎病毒相关抗原检测

为了解北京市售生鲜猪肝脏中戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag)的污染情况,本研究从北京超市和农贸市场采集了107例市售生鲜猪肝,采用免疫组织化学染色和HE染色分别对上述样品中的HEV-Ag及其病理形态学变化进行检测和观察。HEV-Ag免疫组织化学染色结果显示107例肝脏样品中有99例呈阳性反应,阳性率为92.52%,且大部分阳性反应物分布于肝细胞胞浆内。HE染色显示免疫组化呈阳性反应的肝脏样品均有不同程度的病理变化,主要表现为肝细胞变性,局灶性或散在单个性坏死;肝小叶中央静脉淤血;肝小叶间或小叶内淋巴细胞呈弥散性或局灶性浸润;小叶间胆管增生和纤维结缔组织增生。上述结果表明,市售猪肝普遍存在HEV感染问题,应引起相关部门重视。

应用巢式PCR检测猪戊型肝炎病毒核酸及其序列分析

根据GenBank注册的AJ272108等序列,利用Oligo6应用软件设计内外2对引物,采用RT-PCR技术对本实验室分离的猪戊型肝炎病毒进行探索性扩增,并对测定的序列进行分析,结果用套式引物扩增出了目的条带,序列分析表明该序列属于基因Ⅳ型,并与其核苷酸同源性在85.6%～94.8%之间,氨基酸同源性在99.1%～100%之间。而与基因Ⅲ型核苷酸同源性最低,与基因Ⅱ型氨基酸同源性最低。

一种新的人兽共患病——猪戊型肝炎研究进展

猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是导致猪戊型肝炎(HE)的病原体,现在很多国家和地区,如美国、日本、欧洲、中国、中国台湾、印度等都检测出了猪戊型肝炎病毒的抗体,少数国家和地区还有人感染猪戊型肝炎病毒的报道,越来越多的证据表明猪HE是一种人兽共患的传染病。

河北省部分地区屠宰猪肝脏戊型肝炎抗原的检测及组织病理学观察

为探讨河北省部分地区屠宰猪戊型肝炎病毒(HEV)的感染情况,采集了55例屠宰猪肝脏,采用免疫组织化学方法对肝脏样品的戊型肝炎病毒抗原进行检测,同时应用H.E.染色和Mallory三色染色法对其病理形态学变化进行观察。结果显示,55例肝脏样品中有52例呈抗原阳性反应,阳性率为94.55%。光学显微镜观察可见,病毒抗原在肝细胞核、胞浆和胞膜上均有分布,但主要呈现胞浆弥漫型和胞核型。组织病理学观察结果显示,在HEV-抗原免疫组化阳性反应肝脏样品的H.E.染色切片中,均有不同程度的病理变化,主要表现为肝细胞变性散在单个核固缩性坏死,淋巴细胞等炎性细胞浸润,汇管区胆管增生,肝细胞萎缩,并常见有纤维结缔组织增生。Mallory三色染色结果显示,有29.1%的肝脏样品中有纤维结缔组织增生。

广西14市猪戊型肝炎的分子流行病学分析

为调查广西猪戊型肝炎(HE)的感染情况,本研究应用套式RT-PCR方法对采自广西14市43个猪场的508份3月龄左右猪只粪样及市售182份猪肝扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特异序列,并进行核苷酸序列同源性分析及遗传进化分析。结果表明,在508份猪粪样中194份可以检测到HEV RNA,阳性率为38.2%;182份猪肝样本中,33份可检测到HEV RNA,阳性率为18.1%;43个猪场中检出HEV RNA的有35个,猪场阳性率为81.4%。所获取的39株广西猪HEV ORF2基因特异序列同源性为89.9%～100%,提示在所调查的广西猪场中已较普遍存在HEV感染,所获取的39株广西HEV阳性样品均属于基因Ⅳ型。本研究结果佐证了感染猪及市售带毒猪肝脏是HEV重要的储存库和传染源,应该重视其公共卫生学意义,预防粪-口途径或者食源性HEV感染。

两种免疫酶试剂盒检测猪抗E型肝炎病毒IgG的比较

目的比较两种免疫酶试剂盒recomWell HEV IgG(swine)ELISA(recom Well )和recomLine HEV IgG(swine)(recom Line )检测猪抗E型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)IgG的准确性。方法分别采用基因3型和基因4型人HEV(human HEV,hHEV)人工感染无菌猪各2头,采用上述试剂盒检测猪感染后不同天数的血清样品中抗HEV IgG,同时对两头接种PBS液的无菌猪血清样品18份和4头未感染猪的18份血清进行了检测。结果 2头猪人工感染基因3型hHEV后,recomWell检测均于感染后21d出现阳性,并持续56d;recomLine检测,其中1头猪于感染后14d呈阳性,而另1头于感染后21d呈阳性,且均持续56d。2头猪人工感染基因4型hHEV后,两种试剂盒检测,其中1头猪于感染后21d呈阳性,另1头35d呈阳性,并均持续56d仍为阳性。18份对照血清两种试剂盒检测均为阴性。18份未人工感染猪血清中,只有1份两种试剂盒检测均为阳性。两种试剂盒同时检测的共72份样品中,recomWell检出阳性样品23份,阳性率约为32.0%(23/72),recomLine检出阳性样品24份,阳性率约为33.30%(24/72),检出阳性率两者差异不显著(P>0.05);在recomWell检出的23份阳性样品中,recomLine检测均为阳性,两者阳性检出符合率为100%(23/23);recomWell的漏检率约为4.1%(1/24)。结论 recomWellR和recomLine均可用于猪抗HEVIgG的检测,recomLine检测灵敏度略高于recomWell,且操作更简便,不需要特殊昂贵的检测设备,特别适合用于基层检测猪抗HEV IgG。

猪戊型肝炎病毒ORF2片段克隆及原核表达

设计套式引物,内套引物含有BamHⅠ/XhoⅡ酶切位点,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)结构蛋白基因ORF2部分片段,长度为634bp,将其克隆于PGEX-T载体,测序结果表明插入的片段属于戊型肝炎病毒ORF2部分,将该片段插入PproEXHTb表达载体,经酶切鉴定证实获得了重组表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,经1mmol/LIPTG诱导,得到表达,表达蛋白分子量为27Ku,以包涵体形式存在。Westernblot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。

猪戊型肝炎结构基因ORF2的克隆及其植物表达载体的构建

通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆了戊型肝炎病毒主要结构基因ORF2部分片段,大小为681 bp,将其克隆于pMD18-T载体。序列分析表明,与GenBank公布的序列一致。然后,将该基因亚克隆到植物表达载体p35S-2300-two-T-DNA-4×Ta1上,并将载体p2300上的CaMV35S启动子替换为E12启动子,构建成植物表达载体p2300-ORF2-E12。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得了携带ORF2基因的根癌农杆菌菌株,为转基因植物工作奠定了基础。

大理地区猪源甲型、乙型、戊型肝炎病毒血清流行病学调查

目的:调查大理地区猪体内甲、乙、戊型肝炎病毒的感染情况。方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测屠宰生猪血清标本甲肝血清标志物(HAV-lgG和HAV-lgM)、乙肝血清标记物(HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAbHBcAb)、戊肝血清标志物(HEV-lgG和HEV-lgM)。结果:HAV、HBV和HEV的感染率分别为:91%(162/178),93.9%(185/197),23.6%(42/178);HAV和HBV二重感染率为67.97%(121/178);HAV、HBV和HEV三重感染率为20.2%(36/178);HAV和HEV二重感染率为1.7%(3/178);HBV和HEV二重感染率为2.2%(4/178)。结论:甲、乙、戊型肝炎病毒在猪体内存在感染,同时发现在猪体内甲、乙型肝炎病毒重叠感染常见。

2015年—2016年度南宁部分地区猪戊型肝炎病毒基因型分析

为了解广西猪群中戊型肝炎病毒(HEV)基因型,利用套式RT-PCR用对南宁周边猪场采集到的104份新鲜猪粪便进行HEV检测、分离并成功扩增和克隆了11株阳性毒株的ORF2基因部分保守片段。序列测定结果表明,11株HEV ORF2序列自身核苷酸同源性为97.7%~100%,推导编码的氨基酸同源性为97.9%~100%;与4型HEV代表毒株Ch-S-1、Ch-T11、swGX40等的核苷酸同源性为84.6%~90.6%,而与其他各型之间的同源性较低。系统发育进化树结果表明,11株HEV广西株为基因4型,其中,10株HEV为4a亚型,1株毒株为4e亚型。结果表明,广西猪群中流行的HEV均为基因4型,且以4a亚型为优势流行毒株。

上海郊区猪戊型肝炎病毒分子流行病学调查

为了解上海郊区猪场戊型肝炎病毒(HEV)的感染情况,从3个猪场随机采集180份新鲜粪便样本,用逆转录巢式聚合酶链反应对HEV ORF2部分基因片段进行扩增、克隆及测序。结果表明:HEV RNA的PCR检测总阳性率为15.6%,个别猪场HEV RNA检出率达30%,且存在基因3型和4型同时检出的情况。经NCBI数据库BLAST比对分析,23份样本为基因4型,5份样本为基因3型。遗传进化分析显示,基因3型和4型毒株与来源于上海地区的参考毒株遗传关系最近,核苷酸同源性分别为97.9%和96.3%。研究表明,上海郊区某些猪场HEV感染率仍较高,且存在基因3型与4型共感染的现象,应注意加强防控。

猪戊型肝炎病毒ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢的lncRNA-mRNA调控网络的鉴定

为初步鉴定并挖掘出猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,本试验通过构建腺病毒过表达载体,制备高滴度过表达腺病毒,介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中实现过表达。Western blotting检测ORF3蛋白过表达成功后,运用lncRNA高通量组学测序,筛选出差异表达的lncRNA并进行靶向差异基因预测,对lncRNA靶向差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,初步鉴定出与核黄素代谢信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络。Western blotting结果显示,在约为12 ku处出现目的条带,说明成功实现腺病毒介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中过表达。lncRNA高通量组学测序结果显示,共发现102个显著差异表达lncRNAs表达量上调,80个显著差异表达lncRNAs表达量下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,初步挖掘出lncRNA(MSTRG.13995.2)和lncRNA(MSTRG.1960.1)可能是与核黄素代谢信号通路相关的显著差异表达lncRNA,分别通过顺式调控其靶向基因APC-5和FLAD1来影响核黄素代谢信号通路。本试验初步鉴定出lncRNA(MSTRG.13995.2)-APC5和lncRNA(MSTRG.1960.1)-FLAD1可能是影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络。

大理地区屠宰生猪的戊型肝炎病毒的流行病学调查

目的:了解大理地区猪群中猪戊型肝炎的感染情况,为大理地区戊型肝炎的防治提供一定的理论依据。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对屠宰生猪510份血清中戊型肝炎病毒(HEV)抗体进行检测,应用免疫组织化学染色法对152份屠宰生猪肝脏样本进行HEV相关抗原检测,并对肝脏样本进行组织病理学观察。结果:(1)HEV-IgG阳性率为17.5%(89/510),HEV-IgM阳性率为6.3%(32/510),HEV-IgM、HEV-IgG均阳性的标本0份,HEV抗体阳性率为23.7%(121/510)。(2)组织病理学观察发现,68.4%(104/152)的肝组织存在不同程度的病变。(3)免疫组织化学染色结果表明,63.2%(96/152)的肝脏标本呈HEV抗原阳性。结论:大理地区猪群中HEV感染率较高,相关部门应予以重视并采取相应措施。

5种外来动物疫病并联荧光定量PCR检测方法的研究

根据GenBank中发表的相关病毒的基因序列,通过分析比较小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、西尼罗河热病毒(WNV)、亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)的保守区域(PPRV的N基因、ASFV的P72基因、HeV和NiV的H基因,以及WNV的PrM基因),各设计筛选出一套特异性引物和Taqman探针,建立了5种外来动物疫病并联荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法,对103份样本进行了临床检测,结果除阳性对照外,其他均为阴性。检测结果验证了本研究建立的Taqman模式并联荧光定量PCR检测方法具有鉴别诊断的特点,可以作为临床检测这5种病原体的参考方法。

新疆猪戊型肝炎病毒株CHN-XJ-SW33全基因组序列分析

目的测定从新疆南部地区分离的猪戊型肝炎病毒（HEV）株全基因组序列,并在此基础上分析猪HEV与人源HEV的关系。方法设计HEV基因4型通用PCR引物,用逆转录巢式聚合酶链反应法（RT-nPCR）分段扩增猪HEV株CHN-XJ-SW33的全基因组序列;用cDNA末端快速扩增法（RACE）扩增其末端序列;对扩增的目的片段进行克隆测序,并对拼接后的基因组进行序列比对和进化分析。结果除3′poly（A）尾外,CHN-XJ-SW33基因组全长为7 238 nt,由3个开放读码框（ORF1-3）组成,分别编码1 706、674和114个氨基酸。CHN-XJ-SW33全基因组序列与HEV基因1-3型病毒株同源性仅为72.1%~74.9%,而与HEV基因4型病毒株同源性高达82.8%~95.5%,其中与日本人源中国输入型HEV株JKO-ChiSai98C同源性最高,为95.5%。基因进化分析显示,CHN-XJ-SW33属于HEV4a基因亚型。结论猪HEV与人HEV在全基因组核苷酸序列上高度同源,提示基因4型HEV可能由猪传染给人。

猪和鸡戊型肝炎病毒基因重组分析

鸡戊型肝炎病毒（avian Hepatitis E virus,a HEV）衣壳蛋白的抗血清可以与猪戊型肝炎病毒（swine Hepatitis E virus,s HEV）的衣壳蛋白发生交叉反应,提示上述两种病原之间存在某种相关性。为了研究s HEV和a HEV之间是否存在基因重组现象,试验应用生物信息学方法对s HEV和a HEV的重组进行了系统分析,共收集了具有代表性的61条s HEVs全基因组序列,11条a HEVs全基因组序列,应用RDP4.24和Sim Plot3.5.1生物学软件对重组事件进行了分析。结果表明：a HEV与s HEV之间没有发现明确的重组信号,但s HEV间存在两个重组信号,分别存在于DQ450072毒株的1 993~2 724位核苷酸碱基和4 745~5 754位核苷酸碱基区间内。说明a HEV与s HEV之间不存在重组现象。

猪戊型肝炎病毒黑龙江分离株SWHLJ-BXBX全基因组序列的测定与分析

为了研究猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)黑龙江分离株SWHLJ-BXBX的全基因组序列,并对其序列特征和进化关系进行分析,试验采用RT-n PCR、5'-RACE、3'-RACE方法和Megalign、MEGA 6等生物学软件对SWHLJ-BXBX的全基因组序列进行了研究。结果表明:SWHLJ-BXBX全基因组序列去除poly A后全长为7 240 bp,5'UTR有25个碱基,3'UTR全长为70 bp,ORF1编码1 707个氨基酸,ORF2编码674个氨基酸,ORF3编码114个氨基酸,进化树分析表明SWHLJBXBX属于HEVⅣd基因亚型。