我国猪群中多杀性巴氏杆菌的基因型分析

本研究旨在了解我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌(Pm)的主要基因型。利用荚膜基因分型、脂多糖(LPS)基因分型、多位点序列分型(MLST)对2013年12月—2017年12月4年间来源于我国各地区规模化猪场患有疑似呼吸系统疾病的病死猪肺、鼻拭子、气管、肝等样品中分离鉴定的Pm进行基因型分析,并对23种主要毒力基因进行检测。结果表明,当前在我国猪群中流行的Pm的荚膜基因型为A(48.85%)、D(42.75%)、F(2.67%),优势基因型为A和D;LPS基因型为L3(25.00%)和L6(75.00%)型,优势基因型为L6;MLST基因型为ST3(21.25%)、ST10(27.50%)、ST11(42.50%)、ST12(2.50%)、ST16(2.50%)、ST74(1.25%)及ST75(2.50%),优势基因型为ST3、ST10和ST11。如果将荚膜基因型、LPS基因型和MLST基因型组合起来看,当前在我国猪群中流行的Pm的主要基因型为荚膜:脂多糖:MLST基因型A:L3:ST3(20.00%)、A:L6:ST10(26.25%)及D:L6:ST11(42.50%)。毒力基因检测的结果发现部分毒力基因的分布表现出一定的"基因型偏好性"。结果提示,D:L6:ST11是我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的主要基因型,可能与我国猪群中由多杀性巴氏杆菌导致的呼吸道疾病密切相关。

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

为了解各血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)在四川、重庆、云南的流行情况,对2013—2014年间四川、重庆、云南等地8个规模化养殖场的125份病死猪肺炎样品进行细菌分离,并用PCR方法对分离的多杀性巴氏杆菌进行鉴定及荚膜血清分型。结果表明:从有肺炎症状病死猪的肺脏样品中共分离出11株多杀性巴氏杆菌,其中有7株为A血清型(63.6%),3株为D血清型(27.3%),1株为F血清型(9.1%),没有发现B和E血清型。表明在该区域内,猪肺疫主要是由A型Pm感染引起。另外,此次还分离出了1株较少见的F型多杀性巴氏杆菌。该结果可为上述地区巴氏杆菌病的防治提供科学材料。

猪源A型和D型多杀性巴氏杆菌强毒菌株的生物学特性比较研究

为分析猪源A型和D型多杀性巴氏杆菌(PM)的生物学特性差异,本研究对5株A型和5株D型猪源PM强毒菌株的生化特征、生长特性、毒力特性、16SrRNA基因分子特征等生物学特性进行了比较研究。在TSB液体培养基中的生长曲线测定结果表明这些菌株均能够高密度发酵培养;21种生化试验的反应结果表明,10株PM的生化反应均不一致,即使同一血清型的不同菌株之间也具有较大差别。对小鼠毒力试验结果表明,A型PM菌株的毒力(LD_(50)为4 cfu^26 cfu)显著强于D型菌株(LD50为2.1×10~4 cfu^5.2×10~5 cfu)。16SrRNA基因的序列分析结果表明,16SrRNA基因非常保守,这10株PM之间的同源性均在99.8%以上;在1 505 bp序列中,仅存在第57 bp(T/C)、239 bp(T/C)和376 bp(G/C)处3个多态性位点,并且不具有型特异性。本研究为猪源PM灭活疫苗菌株的筛选等提供了实验依据。

猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达

皮肤坏死毒素(Dermonecrotictoxin,DNT)是产毒素多杀性巴氏杆菌(ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T+Pm的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列,共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序,结果表明,toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99.8%以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得大小约173000的融合蛋白。Westernblot结果表明,该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明,该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体,并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。

对流免疫电泳鉴定猪源多杀性巴氏杆菌血清型

通过特异性试验、敏感性试验、阻断试验等建立鉴定猪源多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida血清型的对流免疫电泳(CIE)技术。结果表明,抗原、抗体之间具有较好的特异性,而且有着很好的重复性;敏感性较琼脂扩散试验至少提高4倍;对本实验室分离的13株Pm进行荚膜血清型分型鉴定显示,A型(8/13,61.54%)、D型(5/13,38.46%),符合PCR鉴定结果。本方法具有快速、特异等特点,且不需要特殊设备,操作简便。

三种猪用疫苗联合免疫的可行性分析

为简化免疫程序,减少免疫次数,降低反复多次免疫对猪只的应激,采用三种猪用疫苗联合免疫进行可行性分析。首先将猪瘟、猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌病三联活疫苗与猪伪狂犬病活疫苗进行混合,测定了混合后猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪丹毒杆菌和多杀性巴氏杆菌的活性。同时,在试验猪群中开展混合疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗同步两点注射的联合免疫效果评价。结果显示,三联活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗的混合疫苗与猪圆环病毒2型灭活苗的联合免疫不会降低疫苗的免疫效果,且能够达到较单独免疫更好的免疫效果,表明采用三种猪用疫苗进行联合免疫是完全可行的。

猪D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素分段基因的原核表达

根据GenBank已发表的产毒素多杀性巴氏杆菌(T+Pm)toxA基因序列(AF240778)设计1对引物,从猪源D型T+Pm中扩增出toxA基因片段(3858 bp),再根据toxA基因序列设计3对引物,分别扩增出ZQ(1084 bp)、ZH(1092 bp)、HM(906 bp)3个分段基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,转入大肠杆菌BL21中进行融合表达。经SDS-PAGE和West-ern blotting检测分析,发现ZQ、HM基因的表达产物以包涵体形式存在,大小分别为75、50 kDa,ZH基因不表达。动物试验结果表明,HM重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性,而ZQ重组蛋白没有免疫原性、反应原性及生物学活性。通过间接ELISA的方法检测抗毒素的阳性猪血清,结果表明,HM重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性。

猪肺疫的病原分离与鉴定

猪肺疫又称“锁喉疯”，它是由猪多杀性巴氏杆菌引起，具有发病急，死亡快的特点。该病在温州地区自2014年7月至2015年8月，时有发生。本文主要针对永嘉、平阳等地猪场送检的4份猪肺疫疑似病料，开展了相关试验。通过病料触片染色，分离纯化、生化试验、PCR分型鉴定，结果表明分离到4株猪源巴氏杆菌，血清型均为A型。随后，对分离菌株进行了小白鼠毒力试验，结果表明均对小白鼠有很强的致病性。这些试验的开展，为猪肺疫暴发的地区，选用A型疫苗菌株预防该病提供了理论依据。

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及oppA基因遗传进化分析

【目的】了解福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的流行及oppA基因遗传进化情况。【方法】本研究采用细菌分离培养、生化试验、16S rRNA PCR扩增测序、PCR荚膜分型、oppA基因克隆及相似性分析、动物回归试验等方法对分离菌株进行鉴定和分析。【结果】本研究共分离到10株菌,分离菌在血平板上形成淡灰白色、湿润光滑、奶油露珠状菌落;分离菌株能酵解蔗糖、果糖、麦芽糖和甘露醇,不能分解葡萄糖、枸橼酸盐、乳糖、硫化氢等,与多杀性巴氏杆菌生化特性基本一致;分离菌株16S rRNA序列与GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌相似性达99.9%以上,10株分离菌均为多杀性巴氏杆菌;PCR荚膜分型显示,6株分离菌为荚膜A型,4株为荚膜D型;基于oppA基因的遗传进化树显示,10株分离菌均位于同一分支内;动物回归试验结果显示,在24 h内攻毒小鼠死亡率较高(21/30),分离菌有较强的致病力。【结论】福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌流行菌株的荚膜血清型主要是A和D型,且大部分菌株都来源于共同的祖先,本研究结果丰富了猪多杀性巴氏杆菌的流行病学资料,并为该病的防控奠定基础。

上海市猪源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及其耐药性分析

本研究旨在调查上海市猪源多杀性巴氏杆菌对临床常用抗菌药的耐药情况,为该病的药物预防与治疗提供科学依据。2014~2015年在上海市11个规模化养猪场采集疑似多杀性巴氏杆菌感染的病料共计116份,采用细菌分离培养及PCR方法,分离鉴定出20株多杀性巴氏杆菌。采用纸片法测定了分离菌株对20种临床常用抗菌药的敏感性,结果表明,所有菌株对阿莫西林克拉维酸、头孢曲松、恩诺沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和多黏菌素B敏感,这6种药物可作为本地区控制本病的首选药物。然而,超过50%的菌株对青霉素（65.0%）、复方新诺明（65.0%）、氨苄西林（60.0%）、链霉素（60.0%）、四环素（60.0%）耐药。耐药谱分析显示,85.0%的菌株对4~7种抗菌药耐药。本研究结果表明上海市猪源多杀性巴氏杆菌对临床常用抗菌药物耐药较严重,应加强养殖场猪多杀性巴氏杆菌的耐药性监测与防控。

猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素基因的原核表达

参照GenBank收录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(AF240778),设计一对引物,从猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌中扩增出toxA编码区3 858 bp的片段,将其克隆至原核表达载体PET-32a,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行融合表达多杀性巴氏杆菌毒素。SDS-PAGE和Western blot分析证实,该表达产物以包涵体形式存在,大小约175 ku。动物试验结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性。通过间接ELISA方法检测抗毒素的猪阳性血清,表达重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性,为多杀性巴氏杆菌毒素进一步应用奠定了基础。

猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原菌选择性显色培养基的研发和应用

为研制便于检测猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原含量的选择性显色计数琼脂(以下简称猪三联显色培养基)以代替传统的马丁琼脂,对比研究了干粉马丁琼脂、新鲜马丁琼脂和猪三联显色培养基的理化特性和生长特性,并通过活菌计数方法平行对比了猪丹毒单价苗、猪肺疫单价苗和猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗的抗原含量。结果显示,猪三联显色培养基在活菌计数的准确性和重复性上均与干粉马丁琼脂保持一致,而且两种菌的菌落回收率均能达到0.9以上。研究表明,猪三联显色培养基可以代替马丁琼脂作为检测猪丹毒和猪肺疫抗原菌含量的计数琼脂,在猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗生产过程中监测疫苗质量。

猪多杀性巴氏杆菌OmpW、TbpA蛋白的原核表达及免疫原性研究

【目的】研究猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白的免疫原性,探索其作为疫苗候选抗原的可能。【方法】对NCBI中不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中OmpW和TbpA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并对OmpW和TbpA蛋白进行生物信息学分析。基于此,构建重组表达菌株pET28a-OmpW-BL21和pET28a-TbpA-BL21,重组OmpW和TbpA蛋白经镍柱亲和层析纯化后与氢氧化铝佐剂混匀制备亚单位疫苗,免疫小鼠后使用猪多杀性巴氏杆菌GX-PmD4菌株攻毒,评估OmpW和TbpA蛋白的免疫原性。【结果】相似性比对发现,OmpW和TbpA蛋白在不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中高度保守;SignalP 6.0 Server和TMHMM Server v.2.0软件预测发现OmpW蛋白有信号肽和跨膜区,而TbpA蛋白有信号肽无跨膜区;ABCpred软件分析显示,OmpW和TbpA蛋白分别有14和22个B细胞抗原表位;SOPMA和SWISS-MODEL软件进一步预测蛋白结构表明:OmpW和TbpA蛋白的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占16.18%、5.39%、36.76%、41.67%和40.42%、5.69%、16.77%、37.13%。经原核表达获得的重组OmpW和TbpA蛋白均具有较强的抗原性。在免疫小鼠后的14和28 d,与对照组相比,血清中OmpW、TbpA特异性抗体水平极显著上升(P<0.01)。小鼠免疫攻毒试验结果显示,重组OmpW组和TbpA组的小鼠存活率分别为50.0%和37.5%。【结论】本研究成功表达了猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白,且重组OmpW蛋白免疫原性较强,可作为猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效候选抗原。

猪巴氏杆菌、大肠杆菌二联苗的制备及免疫效果观察

以分离某猪场的多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌制备猪巴氏杆菌和大肠杆菌二联灭活苗,同时选择病变明显的病料制备组织灭活苗,探讨它们的免疫效果。结果发现它们的免疫保护率分别为:二联灭活苗为80%以上,组织灭活苗为60%。因此二联苗可试用于控制该猪场巴氏杆菌病的流行。

猪瘟、猪圆环病毒2型和多杀性巴氏杆菌混合感染的实验室诊断

2017年6月,黑龙江省大庆市某猪场爆发疾病,病程为7~10 d,临床症状主要表现为呼吸困难、病猪卧地不起、有间歇性咳嗽、食欲不良、体温升高、腹泻、病猪表皮有褐色斑点等症状。无菌采取病猪肺脏等病料提取DNA和RNA,进行聚合酶链式反应(PCR)检测,同时分离菌进行革兰氏染色镜检、生化试验和药敏试验等。PCR扩增出结果为猪瘟、多杀性巴氏杆菌和猪圆环病毒2型的混合感染。药敏试验结果显示恩诺沙星和头孢噻肟对分离菌高度敏感。

用冻干菌液进行猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验的研究

在猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的效力检验中,需要进行动物攻毒保护试验。传统方法使用的是2~8℃保存的新鲜菌液对试验动物进行攻毒。本研究中使用的是低温保存的冻干菌液,并对冻干保存的菌数进行了测定和优化。结果表明,冻干保存的菌液能达到新鲜菌液同等的检验结果。同时,对冻干菌液保存期进行试验验证,发现细菌存活状态稳定。因此,在猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验中,可将新鲜的攻毒菌液冻干保存,用于攻毒保护试验,以避免每次繁重的新鲜菌液前期准备工作,并克服活菌数衰减所造成的检验结果不准确等问题。

泰拉霉素注射液对自然感染猪呼吸道疾病的治疗效果

试验旨在考察泰拉霉素注射液治疗自然感染猪呼吸道疾病的有效性和安全性,为临床合理用药提供参考。在发生呼吸道疾病的某规模化猪场按标准遴选120头患病猪,随机分成2组(每组60头猪),两组试验猪分别注射受试及对照泰拉霉素注射液,用药1次,给药剂量均为2.5 mg/kg。试验期11 d。结果显示:泰拉霉素注射液治疗自然感染呼吸道疾病的试验猪效果良好,用药后试验猪鼻腔定植的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌等病原菌可被及时清除;发热、呼吸困难、精神沉郁、食欲不振等症状可获得快速、持续改善直至消除;试验第11 d,试验猪的治愈率超过75%,有效率超过95%,且未见不良反应。研究表明,受试泰拉霉素注射液用于治疗猪呼吸道疾病安全、有效,可在临床中可推广应用。

不同方式制备的猪胃消化液对培养猪多杀性巴氏杆菌(EO630株)的影响

在猪多杀性巴氏杆菌(EO630株)的菌液生产中,使用不同方式制备的猪胃消化液马丁汤培养基生产猪多杀性巴氏杆菌菌液,菌液菌数差异明显。结果表明用温室消化的猪胃消化液制备的马丁汤培养基有利于提高培养菌数。

猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗(EO630株)生产用合成培养基的研究

为便于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗(EO630株)质量控制和降低生产成本,研制了ZJ-1和ZJ-2两种合成培养基,并进行了两种合成培养基与马丁肉汤的比较试验。结果表明,合成培养基ZJ-1培养活菌数高于ZJ-2和马丁肉汤。用合成培养基ZJ-1培养制备3批疫苗,并分别用兔进行安全检验和小鼠效力检验。3批疫苗对兔均2/2健活,对小鼠的保护力分别为9/10、9/10、8/10,符合产品质量标准。本试验表明,运用合成培养基替代传统培养基是可行的。

猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为确定导致猪细菌性感染死亡的病原,从送检病死猪肺中分离纯化出1株细菌,通过对该菌株进行培养特性观察、生化反应、药敏试验、动物致病性试验,并采用PCR对该分离菌株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰染色为阴性。生化试验及PCR鉴定结果显示,该分离菌株为荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌,其对小鼠有强致病性。此次分离的这株多杀性巴氏杆菌形态结构和生化特性比较典型,毒力较强,且为较少见的荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌。这一结果为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定了基础。