香蕉果实SMART cDNA文库的构建及利用PCR方法筛选香蕉Actin2基因

利用SMART(switching mechanismat5’end of RNA transcript)技术,提取果实少量总RNA,经15-25轮LD-PCR扩增获得全长ds-cDNA,构建了海南主栽的食用香蕉巴西蕉(Musa AAA Group Cavendish)果实的cDNA文库。所构建的文库容量为5×106Pfuml-1,重组率93%。利用此cDNA文库,采用96孔板PCR法筛选香蕉Actin2基因,测序结果显示,序列全长1723bp,编码区长1134bp,编码378个氨基酸,与蝴蝶兰Actin2基因序列同源率达83%,已递交GenBank,接受号692696。

毛尖紫萼藓干旱胁迫cDNA文库的构建(英文)

干旱胁迫是影响植物生长发育的主要环境因素,严重影响农作物的产量。解决这个问题的有效途径是培育和利用优良的抗旱品种。应用比较功能基因组学方法筛选抗旱相关基因,并通过基因工程培育抗旱品种已成为植物遗传资源与品种改良研究的重要内容。毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）是典型旱生藓类,生长在向阳的裸岩上,具有很强的抗旱能力,是很好的抗旱基因资源。本研究采用SMART技术构建毛尖紫萼藓干旱cDNA文库,文库滴度为2.8×105pfu.mL^-1,重组率为91.7%,插入片段大小为5002 000 bp,平均为800 bp。通过测序我们获得了1 045条ESTs,其中高质量的996条,通过拼接获得875个Un igenes,为进一步筛选抗旱相关基因奠定了基础。

利用同源重组构建人脑的酵母双杂交cDNA文库

目的 利用SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建人脑全长cDNA文库。方法 利用SMART技术，以人脑总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离PCR，扩增双链cDNA。同时构建pGADT7-Rec质粒载体。纯化的ds cDNA与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态Y187，经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD／-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人脑cDNA文库。结果 所获得的文库容量为1．2×10^6，重组子不同插入片断大小在0．3～2kb之间。结论 在酵母菌株Y187成功构建了用于酵母双杂交的人脑cDNA文库。

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换（SMART）技术构建了柞蚕（Antheraea pernyi）蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×10^5个独立克隆,插入片段长800-2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签（EST）测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因（Gen-Bank登录号：FJ788508）,该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。

常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)

目的 利用 RNA转录 5′末端转换机制 (SMART)构建适合免疫筛选的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库。方法 通过反转录 PCR和长距离 PCR获得常氏肝癌细胞的全长 c DNA,然后利用 SMART c DNA文库构建试剂盒建立经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞c DNA文库。结果 通过测定 ,高质量的包含常氏肝癌细胞全长 c DNA的 c DNA文库得到建立 ,扩增 c DNA文库的滴度高达 4.5× 10 10 pfu· ml- 1,重组子内平均插入外源基因片段长度在 2 0 0 bp到 40 0 0 bp之间 ,约 150 0 bp左右 ,并且此文库适合免疫筛选。结论 结果显示所构建的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库具有很高的质量 ,为进一步研究常氏肝癌细胞和筛选相关基因获得 c

应用SMART技术构建甘蔗叶片全长cDNA文库

以甘蔗(Sac charum officinarum Linn)为材料,利用SMART技术构建甘蔗叶片全长cDNA文库,从甘蔗叶片中提取总RNA并分离mRNA,用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链,通过长距离PCR扩增得到足量的双链cDNA,同时比较了不同双链cDNA与载体的连接效率和转化效率。结果表明,所构建的甘蔗叶片cDNA文库库容和重组百分比分别是1.8×106个克隆和98.6%,插入片段长度主要集中在0.6～2.5 kb,平均插入片段长度约为1.2 kb。本研究为国内首次报道甘蔗全长cDNA文库,所构建的文库拥有较好的质量,为项目组进一步开展甘蔗功能基因组学研究提供了平台。

基于甾体皂苷的襄麦冬块根抑制性差减杂交文库的构建

【目的】甾体皂苷是襄麦冬块根主要活性成分之一,为了能在分子水平上实现对相关基因的表达调控,从而使甾体皂苷含量的提高成为可能,筛选参与甾体皂苷合成的蛋白或酶就非常必要。【方法】本实验以襄麦冬始见期块根和采收期块根作为实验样品,构建了不同生育期襄麦冬块根抑制性差减杂交(SSH)文库。【结果】构建的始见期和采收期块根差减文库的外源片段,有效基因序列308条,长度主要分布在250~1000 bp左右,片段平均长度586.99 bp;文库样本序列注释上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM库的基因分别有65.26%、34.42%、63.96%、26.30%、14.94%;样本中分别有23和103个Unigene可注释上12个COG分类与19个KOG分类中;样本中有81个预测基因,可以注释到48种酶与映射到92个代谢通路上;样本基因功能在Biological Process分类中聚集于cellular process和metabiolic process,在Cellular Component主要聚集于cell、cell part和intracellular,在Molecular Function分类中主要聚集于catalytic activity,binding和transferase activity。【结论】本实验成功构建了基于甾体皂苷的襄麦冬块根抑制性差减杂交文库,筛选出一批差异表达目的基因。

一种快速分析香蕉果实采后mRNA水平变化的新方法

采用SMARTPCRcDNA合成与计算机软件相结合的方法,快速分析香蕉果实采后mRNA水平的变化。在28℃条件下分别将处于同株同穗同梳相邻位置的香蕉果实放置24、48、72h。应用这种方法对其总mRNA水平进行了分析,结果表明,香蕉采后48h时,与采后0h相比,mRNA水平最高。该方法由于使用了计算机软件TheScionImage,可对cDNA电泳图进行数字化分析,具有用材少,敏感性高,快捷方便等特点,特别适用于对较多样品进行分析。

莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库的构建和鉴定

目的:构建莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库,以便研究与莱芜猪优良性状相关的基因。方法:采用改良的异硫氰酸酸胍一步法制备总RNA;利用SMART技术,以PrimeScript反转录酶逆转录合成第一链cDNA,通过LD-PCR扩增获得cDNA双链;经蛋白酶K消化和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,收集500 bp以上的cDNA片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,建成原始文库;随机挑取单菌落,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定重组子插入片段大小。结果:经鉴定,原始文库的滴度为2.8×105 cfu/mL,重组率约为98%,插入片段大小为0.5～2 kb,平均插入片段长度大于1 kb。结论:建立的cDNA文库质量良好,可以用于目的基因的筛选。

绿僵菌异戊烯基转移酶基因的克隆及表达谱分析

【目的】克隆绿僵菌异戊烯基转移酶(Mpt)基因,了解该基因的结构和表达特征。【方法】采用SMART(Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript)技术和PCR技术,扩增Mpt基因全长cDNA序列和DNA序列,用qRT-PCR方法分析该基因在绿僵菌不同侵染时期的表达谱。【结果】Mpt基因含2个外显子和1个内含子,CDS区为1026bp(GenBank登录号GU271134),编码341个氨基酸;qRT-PCR分析表明,该基因在绿僵菌侵染的不同时期表达水平有显著差异,特别是在寄主昆虫体内生长的后期高表达。【结论】首次克隆了绿僵菌的Mpt基因,弄清了该基因具有在侵染后期高表达等特征,为研究该基因的功能奠定了基础。