α-Synuclein蛋白聚集状态与帕金森病形成

帕金森病是一种常见的老年神经退行性疾病,其致病机理复杂.其中α-synuclein基因是较早发现的与帕金森病相关的基因,其编码的α-synuclein蛋白是帕金森病神经元内出现的一种蛋白包涵体结构——路易体的主要组成成分.最近的研究结果显示,α-synuclein蛋白存在不同聚集状态间的转换,其中聚集过程中形成的寡聚体中间构象具有较强的细胞毒性,可能对帕金森病的发病过程有着重要作用;而且这种聚集状态的转换过程受到多种遗传学与细胞学因素的影响,从而在某种程度上反映了帕金森病发生形成的遗传学与细胞学机制.本文将对α-synuclein蛋白聚集状态转换特性及其在帕金森病发病过程中作用机制方面的研究进展作一综述.

α-synuclein蛋白与A-β肽和β-synuclein蛋白相互作用位点的预测

α-synuclein蛋白的异常聚集是引起帕金森病的重要因素.实验研究发现,α-synuclein蛋白能与多个蛋白相互作用.在相互作用的蛋白质中,有的可以促进α-synuclein的异常聚集,如A-β肽;有的可以抑制α-synuclein的异常聚集,如β-synuclein蛋白,但促进或抑制α-synuclein异常聚集的机理并不明确.利用SYBYL和AUTODOK软件模拟α-synuclein蛋白与A-β肽和β-synuclein的相互作用,找到其相互作用位点,为进一步研究α-synuclein蛋白的异常聚集提供理论依据.

a-Synuclein蛋白与帕金森病

α-Synuclein蛋白是一种神经元特异性突触前膜蛋白,也是Lewy小体的重要组成成分.近年研究认为,α-Synuclein与帕金森病的关系密切.本文就其基础研究及在帕金森病中的意义作一综述.

酿酒酵母中α-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson's Disease,PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一。研究显示,α-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用。以酿酒酵母为模式系统,通过调控α-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响α-synuclein聚集状态的因素,对α-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究。结果表明,α-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性,而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关;超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解α-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制。上述结果表明,蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在α-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用。

二苯乙烯苷对转α-synuclein蛋白基因细胞的影响

目的：建立α-synuclein基因转染细胞＋A8的拟AD细胞模型，研究二苯乙烯苷在体外对拟痴呆细胞模型的作用，探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯苷（TSG）神经保护的作用机制，

溶酶体自噬途径降解α-synuclein蛋白作用研究

目的探讨α-synuclein蛋白细胞内溶酶体途径降解机制。方法用神经生长因子NGF诱导分化PC12细胞作为研究多巴胺能神经元的细胞载体,应用鱼藤酮处理PC12细胞建立α-synuclein蛋白细胞模型。使用溶酶体途径降解抑制剂E64处理神经元样分化的PC12细胞,应用免疫荧光双标方法观察PC12细胞内硫黄素S、α-synuclein蛋白阳性聚集包涵体形成情况,比较各组的差异。结果用E64处理鱼藤酮预处理过的PC12细胞后α-synuclein蛋白聚集且较多包涵体形成(15.36±0.85)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论溶酶体自噬途径可能在α-synuclein蛋白降解、聚集和多巴胺神经元死亡过程中发挥重要作用。

α-Synuclein聚集与帕金森病——影响α-synuclein蛋白聚集的因素

α-synuclein基因是最早发现的与帕金森病相关的基因,在部分家族性帕金森病患者中存在该基因的突变.而无论是家族性还是散发性帕金森病,其特征性包涵体——Lewy小体的主要成分都是聚集的!-synuclein蛋白.目前研究发现的影响α-synuclein蛋白聚集的因素种类繁多.根据其对α-synuclein聚集的影响效应,主要分为促进聚集与抑制聚集两大类,不同因素作用于α-synuclein聚集的不同阶段或不同状态的α-synuclein.值得注意的是,目前研究认为可溶性寡聚物的毒性要强于聚集状态的α-synuclein,因此探讨影响α-synuclein蛋白聚集的因素,尤其是探讨各种因素对α-synuclein聚集状态的影响有重要意义.

二苯乙烯苷对过度表达α-synuclein蛋白的转基因COS-7细胞株的影响

目的观察二苯乙烯苷（TSG）在体外试验中对COS-7细胞株过度表达α-synuclein蛋白的影响。方法将不同浓度的TSG与转染α-synuclein基因的COS-7细胞共孵育24h,应用二甲基噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率,免疫细胞化学和Western免疫印迹法检测α-synuclein蛋白的表达,观察TSG对其的影响。结果TSG在12.5～200.0μmol/L浓度范围内与COS-7细胞孵育24h不影响细胞存活率,而在免疫细胞化学和Western免疫印迹分析中均显示TSG剂量依赖性地抑制α-synuclein蛋白表达和聚集。结论TSG在体外对COS-7细胞过度表达α-synuclein有明显抑制作用。

Numb蛋白对α-synuclein蛋白寡泛素化水平的调控

目的探索Numb蛋白对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)寡泛素化水平的调控。方法分别将EGFP-N1或EGFP-Numb与HA-α-syn共同转染SH-SY5Y细胞;采用细胞免疫荧光法检测α-syn蛋白和Numb蛋白的亚细胞共定位;使用免疫共沉淀的方法检测Numb蛋白与α-syn蛋白的相互结合;利用Western blot检测Numb蛋白对α-syn蛋白寡泛素水平的调控;在MPP+细胞模型中利用细胞免疫荧光检测Numb对α-syn包涵体形成的影响。结果 Numb与α-syn在细胞质中存在亚细胞共定位;Numb蛋白上调α-syn寡泛素化水平;Numb蛋白通过上调α-syn寡泛素水平促进MPP+诱导α-syn阳性包涵体形成。结论 Numb蛋白上调α-syn蛋白寡泛素水平并促进α-syn包涵体形成。

Synuclein蛋白家族

Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 是一个广泛分布于中枢神经系统突触前成分内的小分子蛋白质家族， Ｎ 端以１１ 个氨基酸残基为周期的双极性α螺旋是其二级结构的共同特征． Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 的生理功能目前尚不够明晰， 但大量研究提示ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ可能和突触的发育与可塑性有关． 同时， ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 与阿尔茨海默（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ） 病、帕金森（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ） 病等多种神经系统退行性疾病的关系， 及其在乳腺癌侵袭过程中的作用日益受到关注．

α-synuclein蛋白及LRRK2在帕金森患者血清中的表达及临床研究

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein)、富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repetitive kinase2,LRRK2)在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清中的表达及临床价值研究。方法选取2016年1月-2018年12月皖南医学院弋矶山医院收治的PD患者90例,根据是否腔隙梗死将患者分为腔梗患者25例,无腔梗患者65例;根据空腹外周血高同型半胱氨酸(hyperhomocysteine,Hhcy)将患者分为:Hhcy血症患者29例,正常Hcy患者61例;按Hoehn-Yahr(H-Y)分级修正量表将患者分为:PD1-2级36例、PD2.5-3级34例、PD4-5级20例。另外选取同期在本院进行健康体检的健康老人90例。对比两组研究对象的一般资料、LRRK2、α-synuclein表达水平,并对PD患者各个亚组进行比较,分析LRRK2、α-synuclein表达水平和PD患者严重程度的关系,采用Pearson分析LRRK2、α-synuclein之间的相关性。结果健康对照组、PD两组研究对象性别、年龄、体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05);PD组的LRRK2、α-synuclein表达水平均高于健康对照组,与无合并高血压患者相比,合并高血压患者LRRK2、α-synuclein水平较高(P<0.05)。与无腔隙梗死患者相比,合并腔隙梗死患者LRRK2、α-synuclein水平较高,差异有统计学意义(P<0.05)。与无Hhcy血症患者相比,Hhcy血症患者LRRK2、α-synuclein水平较高(P<0.05)。与12级相比,2.53级、4-5级LRRK2、α-synuclein表达水平升高(P<0.05);与2.5-3级相比,4-5级LRRK2、α-synuclein表达水平升高(P<0.05)。LRRK2、α-synuclein之间均呈正相关(r=0.246,P=0.019)。结论LRRK2、α-synuclein在PD患者血清高表达,且与患者严重程度有关,为临床PD的诊断提供参考。

猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析

目的对猫突触核蛋白（α-synuclein）进行克隆、表达及纯化,并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α-synuclein基因的保守区域内设计引物,从猫脑c DNA文库中PCR扩增得到猫的α-synuclein基因,再将此基因双酶切后克隆到p ET28a原核表达载体中,构建重组质粒,测序正确的重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌,采用IPTG诱导表达。然后对猫α-synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑c DNA文库中扩增出α-synuclein基因,基因全长381个碱基,编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入p ET28a,最后转染大肠杆菌BL21（DE3）,获得可溶性表达的α-synuclein蛋白质,蛋白质分子量为13.12k D,与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α-synuclein蛋白与人源及鼠源α-synuclein氨基酸具有很高的同源性,分别为87.35%和83.15%,但是与鼠和人的氨基酸序列比较,猫α-synuclein氨基酸缺失41～54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α-synuclein具有很好的疏水性,有助于诱导表达时形成可溶性蛋白,这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α-synuclein基因,并在大肠杆菌中实施了可溶性表达,为后期研究α-synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。

γ-突触核蛋白通过调控自噬对结肠癌细胞起保护作用

目的:研究γ-突触核蛋白(γ-synuclein)对内质网应激诱导的结肠癌细胞自噬和凋亡的影响及其细胞保护作用。方法:针对稳定表达γ-synuclein siRNA的人结肠癌HCT116细胞和空载体HCT116细胞,通过基因表达谱芯片分析γ-synuclein下游差异基因,找到可能的自噬及凋亡相关分子。用毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)模拟内质网应激,采用Western blot检测γ-synuclein蛋白、自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、beclin-1、自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5,ATG5)和ATG7]及凋亡相关蛋白{多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]、pro-caspase-3和pro-caspase-9}的表达,CCK-8法检测细胞活力,荧光显微镜观察吖啶橙染色的酸性囊泡细胞器和绿色荧光蛋白标记的LC3,检测人结肠癌HCT116和SW480细胞自噬、凋亡及活力的变化。分别采用γ-synuclein siRNA、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)抑制剂PD98059、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂SP600125和JNK激活剂anisomycin预处理,Western blot检测γ-synuclein及ERK和JNK信号通路相关蛋白表达,检测伴随的HCT116细胞自噬和凋亡的变化,研究γ-synuclein通过调控相关信号通路对细胞自噬的影响及其细胞保护作用。结果:TG模拟内质网应激诱导的结肠癌细胞自噬主要发生在早期(0~24 h),细胞凋亡主要发生在晚期(36~48 h)。内质网应激上调γ-synuclein的表达,并伴有自噬的增强。γ-synuclein早期(0~24 h)通过激活ERK和JNK通路促进自噬,晚期(36~48 h)通过抑制JNK通路抑制凋亡,从而起到保护细胞的作用。γ-synuclein可能在内质网应激诱导的细胞自噬和凋亡之间的过渡发挥一定的作用。结论:在内质网应激环境下,γ-synuclein通过调控ERK和JNK信号通路来促进自噬、抑制凋亡,发挥针对结肠癌细胞的保护作用,这为抗肿瘤治疗提供了一个潜在的思路。

木薯SDH蛋白的序列分析及其与MeH1.2关系的研究

【目的】山梨糖醇脱氢酶(SDH)在调控蔷薇科植物果糖和山梨醇转化中起重要作用,也参与植物对逆境的应答过程,木薯SDH功能的研究可以为培育优质木薯种质提供理论基础。【方法】以‘SC124’的cDNA为模板克隆木薯SDH基因,并利用实时荧光定量PCR分析木薯SDH基因的组织特异性及其对干旱、低温、PEG和ABA的响应模式。通过筛选木薯干旱和低温混合的酵母cDNA文库,并利用Y2H点对点及其双分子荧光互补(BiFC)实验确认与目标蛋白的关系。【结果】木薯SDH基因CDS全长1092 bp,编码364个氨基酸,与数据库中的序列无差异。MeSDH蛋白含有催化锌结合位点,NADP结合位点,结构锌结合位点,属于MDR超家族。烟草叶片表皮细胞瞬时表达显示MeSDH蛋白定位于细胞核。MeSDH基因的表达量在功能叶、幼嫩叶、须根和茎中依次降低。MeSDH基因受干旱、低温和PEG胁迫诱导在木薯叶片上调表达,在ABA处理后的木薯叶片和根系中都显著上调表达。文库筛选、Y2H点对点和BiFC实验证实MeH1.2与MeSDH互作。【结论】MeSDH基因可以响应多种胁迫上调表达,并可能在蛋白水平和MeH1.2共同作用。

超高压预处理紫苏蛋白与大豆蛋白复配蛋白肉的工艺条件优化

利用超高压(ultra-high pressure,UHP)技术预处理紫苏蛋白与大豆蛋白复配蛋白肉,并利用正交实验探究其最佳工艺条件。采用UHP预处理技术,以紫苏蛋白和大豆蛋白等质量比复配为主要原料,谷朊粉、淀粉、牛肉香精和魔芋胶等为辅料制备新型复合植物蛋白肉。采用单因素实验和正交实验考察水分添加量、魔芋胶添加量和UHP压力对蛋白肉产品的咀嚼性、硬度、弹性、黏弹性、蒸煮和解冻特性的影响。复配蛋白肉的最佳工艺条件(以干基计)为水分添加量40%、魔芋胶添加量0.3%、UHP压力500 MPa。在此工艺条件下所得的紫苏蛋白复合肉与纯大豆蛋白肉相比质构性能最佳,其咀嚼性高达46.993 J,比纯大豆蛋白肉高近10倍,并且蒸煮和解冻损失率较低。该研究可为UHP的利用和紫苏蛋白肉的工艺开发提供初步的科学思路,为植物蛋白肉的机制与工艺研究提供一定理论和技术支持。

S100钙结合蛋白β与α突触核蛋白与帕金森病患者抑郁及运动障碍的关系

目的研究帕金森病(PD)患者血清S100钙结合蛋白β(S100β)及α突触核蛋白(α-syn)水平与患者抑郁及运动障碍的关系。方法选择2022年1月至12月聊城市人民医院收治的PD患者194例,根据汉密尔顿抑郁量表评分分为非抑郁组102例(0~13分)及抑郁组92例(≥14分)。运动障碍采用Hoehn-Yahr(H-Y)分级及统一帕金森病评定量表Ⅲ(UPDRS-Ⅲ)进行评分,用多因素logistic回归分析PD患者抑郁的独立危险因素,用Spearman相关性分析血清S100β及α-syn水平与患者抑郁及运动障碍的关系。结果抑郁组体质量指数低于非抑郁组,H-Y分级、UPDRS-Ⅲ评分、S100β、α-syn均高于非抑郁组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。多因素logistic回归分析显示,H-Y分级、UPDRS-Ⅲ评分、S100β、α-syn为PD患者抑郁的独立危险因素(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,PD患者S100β水平与H-Y分级、UPDRS-Ⅲ评分呈正相关(r=0.698,P=0.005;r=0.637,P=0.011);α-syn水平与H-Y分级、UPDRS-Ⅲ评分呈正相关(r=0.654,P=0.021;r=0.611,P=0.035)。ROC曲线显示,S100β、α-syn诊断PD患者抑郁的截断值分别为486.65μg/L、3894.27 ng/L,曲线下面积分别为0.889(95%CI:0.812~0.923)、0.761(95%CI:0.714~0.828),S100β曲线下面积显著优于α-syn(P<0.05)。结论PD患者血清S100β、α-syn水平与其抑郁发生及运动功能障碍密切相关。

基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白,其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治,产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点,特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰,为其功能修饰和创新应用创造了条件,相关研究蓬勃发展,成效显著。大量研究表明,采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略,是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段;此外,采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略,也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制,梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展,并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果,探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径,为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

反刍动物营养与日粮中的蛋白替代技术策略

“大食物观”包含了饲料在内的粮食安全供给,我国饲料粮占粮食总量48.2%,其中蛋白质饲料资源短缺,对外依存度居高不下,给畜产品稳产保供、粮食安全带来隐患,制约着我国畜牧业的发展。牛羊等反刍动物产业既是重要的畜牧产业构成,也是民生产业,文章针对非蛋白氮、低蛋白日粮配制等技术在反刍动物营养与日粮中的应用以及蛋白替代策略进行论述,旨在为反刍动物养殖过程中开源节流、绿色可持续发展提供参考。

富血小板纤维蛋白对难愈合创面炎症反应的影响

目的:研究富血小板纤维蛋白(Platelet-Rich Fibrin,PRF)对难愈合创面炎症反应的影响。方法:将2020年9月至2022年12月承德医学院附属医院烧伤整形科确诊的难愈合创面患者,完全随机分为PRF组、对照组,每组各20例,入院后均进行创面清创碘伏消毒,PRF组创面外敷PRF,隔日换药;对照组无菌敷料包扎换药治疗。于治疗前、治疗后第7天和第14天留取创面组织,进行HE染色来观察创面病理学变化;抽取静脉血分别检测白细胞(White Blood Cell,WBC)、C反应蛋白(C-Reac-tive Protein,CRP)和降钙素原(Procalcitonin,PCT)水平变化;创面组织进行CD34免疫组织化学染色,观察治疗前后创面血管化情况;通过流式细胞术比较治疗前与治疗后第7天患者血液中CD4^(+)T细胞与CD8^(+)T细胞水平变化以及CD4^(+)T/CD8^(+)T比值。结果:两组患者在性别、年龄和入院前病程的比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。HE染色显示,在治疗前,两组患者创面均可见大量炎症细胞浸润,可见少量血管;治疗后第7天,PRF组的炎性细胞浸润减少,血管新生,治疗后第14天,PRF组炎性细胞明显减少,上皮增生,出现新生的皮肤附属器。WBC、CRP、PCT水平,治疗前差异无统计学意义(P>0.05),在治疗后的第7天和第14天时,炎症指标均下降,并且两组差异有统计学意义(P<0.05)。在治疗后第7、14天,PRF组CD34阳性表达细胞多于对照组,新生血管较多,创面上皮化出现也早于对照组。治疗前两组患者CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞和CD4^(+)/CD8^(+)比值无统计学意义(P>0.05);在治疗后第7天,两组患者的CD4^(+)T和CD4^(+)/CD8^(+)比值细胞均有上升,CD8^(+)T细胞均有下降,两组患者CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞及CD4^(+)/CD8^(+)比值比较具有统计学差异(P<0.05)。结论:PRF应用于难愈合创面,能减轻创面炎症反应,改善创面血液循环和免疫功能。