梅毒血清固定患者中NOD样受体蛋白3和Toll样受体4表达与Th1/Th2相关细胞因子的相关性研究

目的探究梅毒血清固定患者中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、Toll样受体4(TLR4)表达与辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(Th1/Th2)相关细胞因子的相关性。方法选取2021年2月至2022年4月川北医学院附属三台医院收治的197例梅毒患者作为研究对象。将进行驱梅治疗后血清转阴者纳入转阴组(n=88),未进行驱梅治疗者纳入梅毒组(n=45),接受驱梅治疗后血清固定者纳入固定组(n=64)。另选取同期进行体检的健康人作为对照组(n=53)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3、TLR4 mRNA相对表达水平;采用酶联免疫吸附试验法检测Th1/Th2相关细胞因子的表达水平;采用Pearson法分析TLR4、NLRP3 mRNA与Th1/Th2相关细胞因子的相关性。结果各组PBMCs中TLR4、NLRP3 mRNA表达水平比较,梅毒组>转阴组>对照组>固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);各组白介素(IL)-2、γ干扰素(IFN-γ)水平比较,对照组>转阴组>梅毒组>固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);各组IL-1β、IL-4、IL-10及IL-18水平比较,对照组<转阴组<梅毒组<固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);梅毒血清固定患者TLR4、NLRP3 mRNA表达与IFN-γ、IL-2呈正相关,与IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18呈负相关(P<0.05)。结论梅毒血清固定患者NLRP3、TLR4 mRNA表达水平显著降低,且与Th1/Th2相关细胞因子密切相关。

重组糖蛋白激素β5/α2调控cAMP/PKA/CREB通路促进3T3-L1细胞脂肪分解的作用及机制研究

目的研究重组糖蛋白激素β5/α2(rCGH)对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响,并探究其潜在机制。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化为成熟脂肪细胞,给予不同浓度rCGH干预24 h。以CCK-8法检测3T3-L1脂肪细胞的细胞活力,酶学方法测定细胞内甘油三酯(TG)及培养上清中甘油的水平,油红O染色观察脂滴变化。Western blot检测各组脂肪细胞中HSL和ATGL脂解蛋白的表达水平。不同浓度rCGH加或不加PKA抑制剂H89对已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞进行联合干预实验,将培养细胞分为对照组、H89预处理组、1μmol·L^(-1)rCGH组和(1μmol·L^(-1)rCGH+H89)联合干预组。酶法测定胞内TG及游离甘油的含量,Western blot检测CREB及脂解相关蛋白的表达。结果不同浓度rCGH(0.25、0.5、1、2μmol·L^(-1))对脂肪细胞细胞活力无显著影响(P>0.05);与对照组相比,rCGH处理显著降低了脂滴大小和细胞内TG含量,同时显著升高了细胞上清液中的甘油浓度。rCGH处理还刺激了p-HSL、ATGL和p-PKA的蛋白表达。此外,加入PKA抑制剂H89,减弱了rCGH对游离甘油水平、细胞内TG含量以及p-HSL、p-PLIN1和p-CREB表达的影响。结论rCGH通过上调HSL、ATGL和PKA活性促进3T3-L1脂肪细胞的脂质分解,促进甘油释放,抑制TG合成和脂质积累,其作用机制与cAMP/PKA/CREB信号通路激活有关。

核因子E2相关因子/血红素加氧酶1及血栓素B2T/6-酮-前列腺素F1α信号通路在宫颈癌根治术后发生深静脉血栓大鼠模型中的作用机制

目的:本研究旨在探讨核因子E2相关因子(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)及血栓素B2(TXB2)/6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)信号通路在宫颈癌根治术后发生深静脉血栓大鼠模型中的作用机制。方法:购买60只4~6周龄裸鼠,体重(180±20)g,随机将60只大鼠分为空白对照组、模型组及深静脉血栓组各20只。其中空白组正常饲养1周;模型组及深静脉血栓组均建立宫颈癌动物模型,模型组造模成功后,正常饲养;深静脉血栓组给予宫颈癌根治术治疗,正常饲养。观察宫颈癌根治术后发生深静脉血栓HE染色切片,原位末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠血管组织内皮细胞凋亡情况,全自动凝血分析仪检测各组大鼠凝血指标,酶联免疫吸附法测定TXB2/6-Keto-PGF1α水平,免疫印迹检测Nrf2/HO-1信号通路。结果:实验过程中,三组大鼠均未出现意外死亡,存活率均为100%。模型组未形成血栓,深静脉血栓组造模后1、3、7、14 d成栓率依次为50.00%(10/20)、95.00%(19/20)、100%(20/20)。大鼠下腔静脉产生的血栓尾部为红色血栓、中间为混合血栓、头部为白色血栓。深静脉血栓组血管内皮凋亡率高于模型组(P<0.05)。深静脉血栓组凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间低于模型组及空白对照组,D-二聚体高于模型组及空白对照组(均P<0.05);模型组凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间低于空白对照组,D-二聚体高于空白对照组(均P<0.05)。深静脉血栓组TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α高于模型组及空白对照组,6-Keto-PGF1α低于模型组及空白对照组(均P<0.05);模型组TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α高于空白对照组,6-Keto-PGF1α低于空白对照组(均P<0.05)。深静脉血栓组Nrf2、HO-1低于模型组及空白对照组,模型组Nrf2/HO-1低于空白对照组(均P<0.05)。结论:TXB2/6-Keto-PGF1α、Nrf2/HO-1信号通路在宫颈癌根治术后深静脉血栓大鼠中异常表达,也是宫颈癌根治术后深静脉血栓形成的作用机制之一。

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显升高(P<0.05);但与IGF-1组比较,PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论IGF-1促进C3H10T1/2细胞成骨分化,其作用机制可能与激活ERK信号通路和p38 MAPK信号通路有关。

食管癌来源外泌体通过E2F4对CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响

目的:研究食管癌来源外泌体对CD4+T细胞向Th17细胞分化的可能作用机制。方法:分离人正常食管上皮细胞HEEC和人食管癌细胞Eca-109来源外泌体(即HEEC-Exo、Eca-109-Exo),同时构建稳定表达的sh-NC和sh-E2F4的Eca-109细胞株并分离其外泌体(即sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo)。应用所得的外泌体处理CD4+T细胞;此外,应用稳定表达sh-NC和sh-E2F4的Eca-109细胞株建立食管癌异种移植小鼠模型。流式细胞术检测CD4+T细胞中Th17细胞比例;qRT-PCR检测E2F转录因子4(E2F4)mRNA表达;Western blot检测E2F4、维甲酸相关核孤儿受体γt(ROR-γt)和IL-17蛋白表达;ELISA试剂盒检测IL-17的含量。结果:与PBS组相比,HEEC-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白的表达、IL-17含量以及E2F4mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与HEEC-Exo组相比,Eca-109-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白表达、IL-17含量以及E2F4 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。与Eca-109-Exo组相比,sh-NC-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白表达、IL-17含量以及E2F4 mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与sh-NC-Exo组相比,shE2F4-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白表达、IL-17含量以及E2F4 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与Eca-109组相比,sh-NC组小鼠肿瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与sh-NC组相比,sh-E2F4组小鼠肿瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:食管癌来源外泌体可能通过E2F4促进CD4+T细胞向Th17细胞分化,从而促进肿瘤生长。

苗药九仙罗汉接骨汤含药血清对MC3T3-E1Subclone14细胞增殖、凋亡和Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2表达的影响

目的:观察苗药九仙罗汉接骨汤含药血清对MC3T3-E1Subclone14细胞增殖、凋亡及Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响,探讨其促进成骨细胞增殖,抑制成骨细胞凋亡的可能机制。方法:将体外培养的MC3T3-E1Subclone14细胞系分为空白对照组、仙灵骨葆胶囊组及九仙罗汉接骨汤含药血清低、中、高浓度组,各组制备含药血清后均用高糖DMEM培养液分别配制成不同浓度进行培养;培养24 h后采用MTT与流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡;RT-PCR与Western Blot、免疫组化法测定Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达。结果:与空白对照组比较,九仙罗汉接骨汤含药血清中、高浓度组增殖能力显著升高,细胞凋亡率显著降低,Runx2、Osterix、Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著升高,Bax mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:苗药九仙罗汉接骨汤可促进MC3T3-E1Subclone14细胞增殖,并抑制其凋亡,其作用机制可能与调节Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2基因及蛋白表达有关。

黄芪甲苷Ⅳ通过抑制TIM-1信号通路增加Th1/Th2细胞比率减轻IgA肾病小鼠肾损伤

目的探讨黄芪甲苷Ⅳ(AS-Ⅳ)对IgA肾病(IgAN)小鼠1型辅助T(Th1)细胞/Th2细胞平衡的影响及其可能作用机制。方法建立BALB/c小鼠IgAN模型,造模成功小鼠随机分为模型组、AS-Ⅳ低、中和高剂量组各10只,另设对照组10只。AS-Ⅳ低、中和高剂量组小鼠灌胃(12.5、25、50)mg/kg AS-Ⅳ混悬液(生理盐水配制),对照组及模型组给予等量生理盐水。测定各组小鼠24 h尿蛋白(24 hUPr)含量和尿红细胞计数;测定小鼠血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)和白蛋白(ALB)水平;ELISA检测各组小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和IL-10水平;流式细胞术检测小鼠外周血Th1/Th2细胞比率;HE染色观察小鼠肾组织病理学变化;反转录PCR和Western blot法分别检测小鼠肾组织中T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域1(TIM-1)、Toll样受体4(TLR4)的mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,AS-Ⅳ低、中和高剂量组小鼠第12周和第15周尿红细胞计数、24 h UPr、BUN、Scr、IL-4、IL-10水平、Th2细胞比例、TIM-1与TLR4 mRNA和蛋白表达水平均明显降低,ALB、IFN-γ水平、Th1细胞比例和Th1/Th2细胞比率升高,且以AS-Ⅳ高剂量组效果最佳。结论AS-Ⅳ通过抑制TIM-1信号通路,增加Th1/Th2细胞比率,抑制炎症反应,减轻IgAN小鼠肾损伤。

过表达M2型肿瘤相关巨噬细胞TIA1基因通过调控PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞侵袭和迁移

目的:探讨过表达M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)T淋巴细胞内抗原1(TIA1)基因对胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移的影响及其机制。方法:从胃癌组织中提取原代TAMs,采用IL-4和IL-13刺激TAMs诱导分化成M2-TAMs,再将TIA1基因过表达质粒(oe-TIA1)及其空载质粒(Vector)转染至M2-TAMs中,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中TIA1 mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞中CD206和CD163表达水平;ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平。通过Transwell共培养体系将转染后的M2-TAMs与胃癌BGC-823细胞共培养,并联用PI3K激动剂740Y-P进行干预,采用划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;Western blot检测细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2和MMP-9等蛋白表达水平。结果:①与原代TAMs比较,M2-TAMs中CD206和CD163表达水平及细胞培养上清液中IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平均显著升高(P<0.05),而TIA1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。TIA1基因过表达可显著降低M2-TAMs中CD206和CD163表达水平及细胞培养上清液中IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平(P<0.05)。②M2-TAMs中过表达TIA1基因可显著降低BGC-823细胞迁移和侵袭能力及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、MMP-2和MMP-9等蛋白表达水平(P<0.05)。③740Y-P可显著逆转M2-TAMs中过表达TIA1基因对BGC-823细胞迁移、侵袭及PI3K/AKT信号通路的抑制作用。结论:过表达M2-TAMs中TIA1基因表达可通过阻断PI3K/AKT信号通路影响胃癌细胞侵袭和迁移。

东紫苏精油对间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的影响及机制

为探讨东紫苏精油对小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的作用及降脂机制,利用噻唑蓝[the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞成活率,以界定浓度的适宜范围;用油红O染色法对东紫苏精油作用后的细胞成脂分化作用进行分析;甘油磷酸氧化酶—过氧化物酶(glycerol phosphate oxidase-p-aminophenazone,GPO-PAP)法、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和4-氨基安替比林苯酚(cholesterol oxidase,peroxidase and 4-aminoantipyrine phenol,COD-PAP)酶法检测东紫苏精油处理后细胞内甘油三酯、胆固醇含量的变化;荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹(western blot)分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxide proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinsα,C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein4,FABP4)mRNA和相关蛋白在成脂分化中的表达水平。结果表明:与空白对照组相比,高脂模型组的总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triacylglyceride,TG)含量显著增加(P<0.05),小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显增加。与高脂模型组相比,中剂量(50μg/mL)和高剂量(100μg/mL)精油组TC和TG含量明显下降,小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显下降。试验结果表明,东紫苏精油可能通过调控PPARγ/C/EBPα/FABP4信号通路发挥对C3H10T1/2细胞成脂分化的抑制作用,达到减脂目的。

不同类型人乳头状瘤病毒感染者CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th1/Th2因子水平分析

目的:探讨不同类型人乳头状瘤病毒(HPV)感染与外周血CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、Th1/Th2因子表达。方法:收集2021年7月-2022年6月就诊于本院的HPV感染者172例临床资料,均行HPV分型检测,并完成检测外周血CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、Th细胞因子,及白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)IL-4和IL-10。比较高危HPV感染与低危HPV感染者以及多重感染与单一感染外周血炎症因子差异。结果:172例HPV感染者中高危型HPV感染80.2%,低危型HPV感染19.8%;单一感染64.5%,多重感染35.5%。高危HPV感染以HPV 16最多,其次为HPV52、HPV58,低危HPV感染以HPV61最多。高危型HPV感染者外周血CD4^(+)T细胞、CD4^(+)/CD8^(+)比值和IL-2、IFN-γ水平均低于低危HPV感染者,CD8^(+)T细胞和血清IL-4、IL-10水平显著高于低危HPV感染者;多重感染者外周血CD4^(+)T细胞、CD4^(+)/CD8^(+)比值和IL-2、IFN-γ水平均低于单一感染者,CD8^(+)T细胞和血清IL-4、IL-10水平显著高于单一感染者(均P<0.05)。结论:不同类型HPV感染者CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞的表达存在差异,高危HPV感染者有着较低的CD4^(+)T细胞、CD4^(+)/CD8^(+)、Th1细胞因子和较高的CD8^(+)T细胞、Th 2细胞因子表达,且多重感染者更为明显。

BRL37344增强3T3-L1前体脂肪细胞pERK1/2蛋白水平

BRI37344是一种选择性β3受体激动剂，有研究表明其在动物模型中表现出良好的抗肥胖作用。本实验研究了BRI37344对细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1／2）的影响，推测其能够抑制前体脂肪细胞分化。

换热器T2紫铜管在水线部位的腐蚀机理研究

目的基于对换热器中T2紫铜管因受残留水作用而出现泄漏降压现象的研究,分析换热器T2紫铜管在水线部位的腐蚀机理。方法通过T2紫铜管的润湿试验,对腐蚀样品进行宏观和微观形貌观察,对点蚀坑部位的腐蚀产物进行EDS和XPS等表征手段分析,探究腐蚀产物的成分和结构,从而推导出反应机理。结果铜管水线上部位和下部位都以均匀腐蚀为主,但是颜色有所差异。水线部位以点蚀为主,肉眼即可见排成直线的斑点状腐蚀坑,腐蚀产物的颜色主要为黑色和绿色。根据表征分析结果可知,腐蚀体系中含有HCO_(3)^(-)和SO_(4)^(2-)。腐蚀产物的组成有,内层Cu_(2)O,外层CuO,水线部位和水线以下部位铜管表面还有一层CuCO_(3)Cu(OH)_(2)膜。结论根据腐蚀产物的元素分析可知,在HCO_(3)^(-)和SO_(4)^(2-)共同存在的环境中,铜具有很高的点蚀敏感性,T2紫铜管很容易发生局部腐蚀,加之氧浓差电池的作用,水线部位铜管发生严重的点蚀以致穿孔失效。

Prdm14对C3H10T1/2细胞增殖及干性的影响

目的探讨PR结构域蛋白14(Prdm14)对C3H10T1/2细胞增殖及干性的影响。方法该实验分为空白对照组(正常C3H10T1/2细胞)、阴性对照组(感染慢病毒空载体的C3H10T1/2细胞)以及实验组(感染Prdm14慢病毒的C3H10T1/2细胞),分别采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹法(WB)检测Prdm14 mRNA及蛋白水平。采用CCK-8及细胞克隆形成实验检测C3H10T1/2细胞增殖情况;通过碱性磷酸酶(ALP)染色及活性测定,观察ALP活性情况;采用WB检测干性因子Sox2、Nanog、Oct4表达。结果与阴性对照组相比,实验组Prdm14 mRNA及蛋白水平均明显升高(P<0.05),ALP活性及细胞增殖能力增强(P<0.05),干性因子Sox2、Nanog蛋白水平均明显升高(P<0.05),Oct4蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论Prdm14可促进C3H10T1/2细胞增殖及干性因子表达。

补肾活血固齿方对大鼠MC3T3-E1细胞BMP2表达及超微结构的影响

目的:研究补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)BMP2表达及超微结构的影响,探讨该方剂治疗牙周炎的作用机理。方法:MC3T3-E1细胞分别于补肾活血固齿方含药血清、无药血清中培养24、48、72 h,ELISA法检测MC3T3-E1细胞BMP2的表达;培养14 d后,透射电镜观察MC3T3-E1细胞超微结构的变化。结果:含药血清组培养上清液的光密度值明显高于无药血清组,统计结果显示差异有显著性(P<0.05)。MC3T3-E1细胞经药物作用后呈现成骨细胞样表型,细胞表面突起变多,核卵圆形、较大,核膜凹陷,核仁明显;胞质丰富,粗面内质网扩张明显,网腔内充满低电子密度絮状物;高尔基复合体、线粒体发达,具有良好的的分泌功能,细胞代谢活跃。结论:补肾活血固齿方能促进MC3T3-E1细胞分泌BMP2,参与诱导成骨作用;补肾活血固齿方能诱导MC3T3-E1细胞呈成骨细胞样表型,促进成骨细胞的分化生长。

骨形态发生蛋白2诱导C2C12和MC3T3-E1的成骨分化与自噬

背景:一系列研究表明自噬与分化有密切联系;骨形态发生蛋白2是诱导C2C12、MC3T3-E1成骨分化经典途径,是研究成骨分化过程的理想模型。目的:观察自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化的关系。方法:Real-Time PCR检测MC3T3-E1与C2C12在骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导培养3 d后成骨与自噬相关指标变化。碱性磷酸酶染色检测不同浓度3-甲基腺嘌呤(0,1,5,10 mmol/L)对骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导培养7 d MC3T3-E1与C2C12成骨指标碱性磷酸酶变化,Western Blot检测C2C12和MC3T3-E1在骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导不同时间点(0,12,24,48,72,96 h)LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平。结果与结论:在骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程中,诱导自噬相关mRNA与蛋白水平均有增高趋势,且自噬相关蛋白LC3水平增高与时间相关。同时,抑制自噬成骨分化过程中碱性磷酸酶表达水平降低。因此,自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程有密切关系。

SLE患者Th1/Th2平衡状态及与外周血淋巴细胞CD28及CTLA-4分子表达的关系

目的:了解SLE患者Th1/Th2平衡状态以及共刺激分子CD28/CTLA-4与Th1/Th2平衡状态的关系。方法:研究对象为18例SLE患者(活跃期12例、缓解期6例)。对照组14例,为健康体检者。外周血单个核细胞(PBMCs)经梯度密度离心法分离后置于含PMA(5μg/L)及ionomycin(500μg/L)培养液中培养72 h。采用ELISA方法检测培养的PBMCs上清液中IFN-γ及IL-10的含量。应用流式细胞技术检测培养的淋巴细胞CD28及CTLA-4分子的表达。结果:活跃期SLE患者培养的PBMCs分泌IL-10的量(351.29 ng/L±153.31 ng/L)较对照组(254.48 ng/L±120.69 ng/L)有一定程度的升高,但差异无显著(P>0.05),IFN-γ的分泌量(25.76 ng/L±16.09 ng/L)明显低于对照组(50.71 ng/L±27.92 ng/L,P<0.05),IL-10/IFN-γ比值(18.74±13.77)明显高于对照组(6.66±4.95,P<0.05)。培养前、后SLE患者CD3+及CD8+T细胞CD28分子表达量与对照组比较均无显著差异。培养前活跃期SLE患者CD3+T细胞CTLA-4分子表达量(0.79%+0.37%)较对照组(1.31%+0.61%)明显降低(P<0.05)。培养后SLE患者CD3+T细胞及CD8+T细胞CTLA-4分子表达量仍低于对照组,但差异无显著(P>0.05)。活跃期SLE患者培养的PBMCs中CD3+T细胞CTLA-4分子的表达量与上清液中IFN-γ含量呈明显的直线正相关关系(r=0.681,P<0.05)、与上清液中IL-10及IL-10/IFN-γ比值呈明显的直线负相关关系(r=-0.624,P<0.05;r=-0.738,P<0.01)。结论:SLE患者存在Th1/Th2平衡向Th2方向偏移,即Th2优势状态。CTLA-4分子可能通过抑制CD28的信号转导参与Th2优势状态的形成。

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1向成骨方向分化的影响。方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证。体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响。以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析。结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确。体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组。在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深。Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05)。结论:Dlx2过表达上调ALP、OCN等成骨相关基因的表达,促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。

六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响

目的探讨六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响。方法制作六味地黄丸混悬液,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄丸含药血清。常规培养MC3T3-E1细胞24 h后更换含10%不同浓度含药血清的培养基,分别培养48 h和72 h后用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞的增殖;对MC3T3-E1细胞进行诱导培养22天后进行饥饿培养24h,随后更换含10%不同浓度的含药血清,培养72 h后检测Runx2、FOXO1 mRNA表达。结果六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,并且呈现一定的剂量依赖性;同时六味地黄丸含药血清各剂量组均能明显促进Runx2 mRNA的表达(P<0.01),高剂量组的表达明显高于低剂量组(P<0.01)。高剂量组的FOX01 mRNA表达明显高于其他3组(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,同时能促进Runx2、FOXO1 mRNA表达。

Foxc2基因对MC3T3-E1细胞成骨能力影响的实验研究

目的探讨Foxc2基因对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响,并初筛其下游的靶基因。方法将多个成骨诱导因子作用于MC3T3-E1细胞,明确Foxc2的表达。采用慢病毒plenti-Foxc2及plenti-EGFP转染MC3T3-E1细胞,构建MC3T3-E1^(Foxc2+)及MC3T3-E1^(EGFP)。检测细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化。采用real-time PCR和Western bolt检测成骨生物标志物Runx2的水平。通过ALP和ARS染色观察Foxc2过表达对成骨分化的影响。利用siRNA构建MC3T3-E1^(si-Foxc2)进行反向验证。通过基因芯片和生物信息学分析,检测MC3T3-E1^(Foxc2+)和MC3T3-E1^(EGFP)基因的整体表达谱。结果Foxc2基因在成骨诱导刺激下出现表达上调。成功构建的MC3T3-E1^(Foxc2+)过表达细胞组,细胞增殖受到抑制,Runx2表达上调。利用基因芯片和生物信息学分析比较MC3T3-E1^(Foxc2+)和MC3T3-E1^(EGFP)的整体基因表达谱差异,初步筛选出可能受Foxc2调控的成骨分化差异表达基因,如mmp9、Ereg等。结论Foxc2基因可通过抑制MC3T3-E1细胞增殖,上调Runx2表达,促进MC3T3-E1细胞成骨分化。mmp9和Ereg等基因可能参与这一成骨调控过程。

胃癌外周血CD4^+-CD25^(high)-Foxp3^+-调节性T细胞异常增高与TGF-β1、PGE_2的相关性分析

目的:探讨胃癌患者外周血中CD4^+-CD25^(high)-Foxp3^+-调节性T细胞(Treg)的比例与血清中转化生长因子β1(TGF-β1)、前列腺素E_2(PGE_2)表达水平的相关性。方法:采用流式细胞术检测26名健康体检者(对照组)和39例胃癌患者(胃癌组)外周血中CD4^+-CD25^(high)-Foxp3^+-Treg细胞比例,同时运用ELISA法检测其血清中TGF-β1、PGE_2的表达水平。结果:胃癌患者的CD4^+-CD25^(high)-Foxp3^+-Treg细胞比例与其TNM分期相关,该比例随TNM分期上升而上升,其中TNMⅢ、Ⅳ期患者与健康对照者间的细胞比例差异有统计学意义(P<0.01)。胃癌组和健康对照的组血清TGF-β1[(14.85±6.16)μg/L比(10.33±3.25)μg/L]和PGE_2表达[(100.46±47.52)ng/L比(74.12±44.96)ng/L]间差异亦有统计学意义(P<0.01),其中TNMⅢ、Ⅳ期患者TGF-β1水平与Treg相关(r=0.750,P<0.01),而PGE_2在TNMⅠ、Ⅱ期和TNMⅢ、Ⅳ期均与Treg相关(r=0.704,P<0.01;r=0.748.P<0.01)。结论:胃癌患者外周血中CD4^+-CD25^(high)-Foxp3^+-Treg细胞比例随肿瘤的进展而增高,而其血清TGF-β1、PGE_2表达水平与CD4^+-CD25^(high)<Foxp3^+-Treg细胞116例相关。