EBV miR-BART17-3p对原发免疫性血小板减少症患儿Treg/Th17平衡的影响

目的探讨EBV mi R-BART17-3p影响原发免疫性血小板减少症(ITP)患儿Treg/Th17平衡的机制。方法收集ITP患儿(ITP组,20例)和健康儿童(对照组,20例)外周血并分离CD_(4)^(+)T细胞。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法、Western blot法、酶联免疫吸附法检测EBV mi R-BART17-3p、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)、叉头框蛋白P3(Fox P3)、白细胞介素17A(IL-17A)和转化生长因子-β(TGF-β)的m RNA、蛋白表达水平及含量。采用双荧光素酶报告基因实验考察EBV mi R-BART17-3p对Tim-3表达水平的影响。将15只BALB/C小鼠随机分为空白对照组、模型组、观察组,各5只。腹腔注射抗血小板抗体MWReg30以复制ITP小鼠模型,建模4 d后观察组小鼠予尾静脉注射携带EBV mi R-BART17-3p inhibitor的腺病毒载体。细胞染色并观察形态,检测外周血中TGF-β、IL-17A含量及血小板计数,采用流式细胞仪分别检测CD_(4)^(+)T细胞中Th17和Treg水平,并计算二者百分比。结果与对照组比较,ITP组患儿外周血EBV mi R-BART17-3p表达水平显著升高,Tim-3和TGF-βm RNA表达水平显著降低(P<0.05);Tim-3 m RNA表达水平与EBV mi R-BART17-3p表达水平呈显著负相关(r=-0.732,P<0.001)。Tim-3慢病毒载体p LKO.1-sh-Tim-3(sh-Tim-3)可显著降低Tim-3、Fox P3、TGF-β水平(P<0.05)。mi R-BART17-3p mimic显著升高了CD_(4)^(+)T细胞中mi R-BART17-3p的表达水平,并显著降低了Tim-3、Fox P3、TGF-βm RNA和蛋白表达水平(P<0.05);mi R-BART17-3p mimic可显著降低TGF-β含量,Tim-3+mi R-BART17-3p过表达逆转了mi R-BART17-3p mimic对TGF-β的抑制作用。动物实验结果显示,沉默EBV mi R-BART17-3p可促进Treg分化,减少脾脏和骨髓组织中的巨核细胞计数,并显著增加外周血中血小板计数。结论EBV mi R-BART17-3p可通过Fox P3/Tim-3途径调节ITP患儿Treg/Th17的免疫失衡。

脓毒症小鼠脾脏CD4+T细胞miR-142-3p的表达与其意义

目的观察脓毒症小鼠脾脏CD4+T细胞的miR-142-3p的表达水平。方法通过盲肠结扎穿孔法建立脓毒症小鼠模型,28只C57BL/6小鼠随机(随机数字法)分为两组:假手术组,脓毒症模型组,每组各14只。所有小鼠均于手术后48 h处死并取材。采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-2,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测小鼠脾脏CD4+T细胞miR-142-3p的水平。结果脓毒症小鼠脾脏CD4+T细胞的miR-142-3p表达水平较假手术组显著升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-2水平均较假手术组显著升高(P<0.05)。结论脓毒症小鼠脾脏CD4+T细胞中miR-142-3p表达上调与炎症相关。

LncRNA NEAT1与miR-495-3p对重症肺部感染的诊断价值及其对T淋巴细胞凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA NEAT1(LncRNA NEAT1)与微小RNA-495-3p(miR-495-3p)对重症肺部感染的诊断价值及其对T淋巴细胞凋亡的影响。方法收集95例肺部感染患者为研究对象,分为重症感染组(50例)与非重症感染组(45例),选取40例健康志愿者为对照组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测NEAT1与miR-495-3p的表达量;采用受试者工作特征(ROC)分析血清NEAT1、miR-495-3p对重症感染的诊断价值。采用免疫磁珠分选外周血T淋巴细胞,分别将si-NC、si-NEAT1转染至T淋巴细胞;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)表达量。结果与对照组相比,非重症感染组、重症感染组患者血清和T淋巴细胞中NEAT1的表达水平显著升高(P<0.05),miR-495-3p的表达水平显著降低(P<0.05),非重症感染组与重症感染组间差异亦有统计学意义(P<0.05);ROC曲线分析显示NEAT1在重症感染诊断时敏感度为82.00%,特异度为84.44%,AUC面积为0.816;miR-495-3p在重症感染诊断时敏感度为78.00%,特异度为82.22%,AUC面积为0.820;与对照组相比,非重症感染组与重症感染组T淋巴细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白水平显著升高(P<0.05),非重症感染组与重症感染组间差异亦有统计学意义(P<0.05);与si-NC组相比,si-NEAT1组T淋巴细胞凋亡率显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05),Bax蛋白水平显著降低(P<0.05),miR-495-3p的表达水平显著升高(P<0.05)。结论重症肺部感染患者血清中NEAT1的表达水平升高,miR-495-3p的表达水平降低,二者对重症肺部感染具有一定诊断价值,沉默NEAT1可能通过上调miR-495-3p表达从而抑制重症肺部感染患者T淋巴细胞凋亡。

长链非编码RNA MIR22HG通过微小RNA-9-3p调节CTLA4抑制前列腺癌

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR22HG通过微小RNA-9-3p(miR-9-3p)调节细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)抑制前列腺癌的机制。方法收集26例前列腺癌组织样本和26例前列腺增生组织样本,培养VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测前列腺癌组织、前列腺增生组织及4种前列腺癌细胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA水平。筛选MIR22HG和miR-9-3p mRNA表达较高的细胞。将筛选出的细胞按不同干预方法分为OE-CTLA4(CTLA4过表达组)、OE-MIR22HG(MIR22HG过表达组)、miR-9-3p mimic(miR-9-3p过表达组)、OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic(MIR22HG及miR-9-3p联合过表达组)、OE-NC+NC mimic(转染对照组)、NC mimic(miR-9-3p过表达对照组)。采用TargetScan数据库及荧光素酶报告基因实验验证MIR22HG与miR-9-3p及miR-9-3p与CTLA4是否存在靶向抑制关系。采用qRT-PCR及Western blot检测各组细胞MIR22HG和miR-9-3p mRNA及CTLA4蛋白表达。取裸鼠96只,按干预方法不同分为OE-NC+NC mimic组(转染对照)、OE-MIR22HG组(MIR22HG过表达)及OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组(MIR22HG及miR-9-3p联合过表达),每组32只。接种后4周期间,每周检测小鼠原位移植瘤并统计瘤体的质量和体积变化。结果前列腺癌细胞VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞中,PC3细胞MIR22HG mRNA相对较低,miR-9-3p mRNA相对较高,因此选择PC3细胞进行研究。在PC3细胞中成功过表达MIR22HG,荧光素酶报告基因实验验证了MIR22HG和miR-9-3p的靶向抑制关系,过表达MIR22HG,miR-9-3p表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。TargetScan数据库预测免疫基因CTLA4和miR-9-3p的靶向关系,荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p和CTLA4的靶向抑制关系,过表达miR-9-3p,CTLA4表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。过表达MIR22HG的裸鼠皮下肿瘤的质量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组裸鼠皮下肿瘤的质量、体积与OE-NC+NC mimic组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论MIR22HG与miR-9-3p存在靶向负调节关系,miR-9-3p与CTLA-4存在靶向调节关系,MIR22HG/miR-9-3p可能通过抑制CTLA4达到免疫治疗前列腺癌的目的。

lncRNA CYTOR/miR-193b-3p/HMGB1轴调控T细胞急性淋巴细胞白血病细胞MOLT-4增殖与凋亡的作用研究

目的 探讨lncRNA CYTOR对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。方法 体外培养人正常骨髓基质细胞系HS-5和T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1),采用逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测细胞中lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1 mRNA表达;采用蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞中HMGB1蛋白表达。分别转染si-CYTOR、miR-193b-3p mimics、si-HMGB1及共转染si-CYTOR与anti-miR-193b-3p至MOLT-4细胞,以CCK-8法检测细胞增殖,以流式细胞术检测细胞凋亡,以Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA CYTOR与miR-193b-3p、miR-193b-3p与HMGB1的调控关系。结果 与HS-5细胞比较,T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)中lncRNA CYTOR、HMGB1 mRNA及其蛋白表达均升高,miR-193b-3p表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。下调lncRNA CYTOR、上调miR-193b-3p或下调HMGB1后,MOLT-4细胞增殖受到抑制,Bcl-2蛋白表达降低,凋亡率和细胞中Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA CYTOR竞争性吸附miR-193b-3p,HMGB1是miR-193b-3p的靶基因。上调HMGB1表达可逆转lncRNA CYTOR对T-ALL细胞MOLT-4增殖和凋亡的作用。敲低miR-193b-3p可逆转lncRNA CYTOR对MOLT-4细胞增殖和凋亡的作用。结论 lncRNA CYTOR在T-ALL细胞系中表达上调,其可能通过竞争性吸附miR-193b-3p进而上调HMGB1的表达来促进T-ALL细胞增殖,并阻碍细胞凋亡,其有可能成为T-ALL治疗的分子靶点。

LncRNA LINC01137通过诱导CD8^(+)T细胞耗竭促进非小细胞肺癌进展的机制研究

目的研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)LINC01137在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)免疫逃逸中的生物学功能及其潜在的调节机制。方法采集24例健康志愿者和24例NSCLC患者血液样本,并收集NSCLC肿瘤组织和癌旁组织检测LINC01137水平。利用Starbase数据库预测LINC01137与miR-22-3p的结合位点,荧光素酶报告基因分析进行验证。采用A549细胞来源的外泌体和/或sh-LINC01137干扰序列转染A549细胞,检测细胞增殖和侵袭能力;收集转染后的细胞上清液培养CD8^(+)T细胞,检测CD8^(+)T细胞耗竭标志物干扰素-γ(interfereron-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、颗粒霉素B(granzyme B)和白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)水平,以及PD-1+Tim3^(+)CD8^(+)T细胞百分比。采用外泌体和/或miR-22-3p模拟物(miR-22-3p mimic)转染CD8^(+)T细胞,检测PD-1蛋白水平。结果与癌旁组织相比,NSCLC肿瘤组织中LINC01137表达(3.357±0.548 vs 1.011±0.371)明显升高;与健康志愿者相比,NSCLC患者外周血LINC01137表达(3.216±0.342 vs 1.007±0.313)亦明显升高,差异具有统计学意义(t=-17.367,-17.147,均P<0.001)。肿瘤组织LINC01137表达与外周血中LINC01137表达呈正相关(r=0.755,P<0.05)。在A549细胞来源的外泌体中LINC01137显著富集。与Exo+sh-NC组相比,Exo+sh-LINC01137组细胞活力(65.852%±4.715%vs 100.153%±11.934%)及细胞侵袭(21.464%±3.481%vs 43.126%±1.447%)能力显著降低,差异具有统计学意义(t=4.630,9.953,均P<0.01)。NSCLC患者外周血中LINC01137表达和CD8^(+)T细胞百分比呈负相关(r=-0.520,P<0.05)。与Exo+sh-NC组相比,Exo+sh-LINC01137组IFN-γ(3865.314±543.852 pg/ml vs 1786.971±105.982 pg/ml),TNF-α(4631.930±510.715pg/ml vs 1973.242±379.623pg/ml),Granzyme B(3876.496±312.438pg/ml vs 1879.439±287.584pg/ml)和IL-2 mRNA水平(3.286±0.437 vs 1.015±0.314)升高,PD-1+Tim3^(+)CD8^(+)T细胞百分比(7.680%±2.185%vs 18.952%±3.216%)降低,差异具有统计学意义(t=-6.497,-7.237,-8.146,-7.310,5.021,均P<0.01)。miR-22-3p是LINC01137的靶基因。与Exo+NC mimic组相比,Exo+miR-22-3p组PD-1蛋白水平(0.384±0.087 vs 1.003±0.147)显著降低,差异有统计学意义(t=6.277,P<0.01)。结论NSCLC患者肿瘤组织及外周血中LINC01137表达显著上调;NSCLC细胞来源的外泌体中LINC01137通过靶向CD8^(+)T细胞中miR-22-3p并抑制其表达,诱导CD8^(+)T细胞耗竭,促进NSCLC细胞免疫逃逸。

miR-338-3p/TCF4对脉络膜微血管内皮细胞增生及凋亡的影响

目的探讨微小RNA-338-3p(miR-338-3p)对脉络膜微血管内皮细胞增生和凋亡的影响及其调控机制。方法体外培养人脉络膜微血管内皮细胞,将培养的细胞分为血管内皮生长因子(VEGF)组和正常对照组,正常对照组细胞常规培养,VEGF组细胞应用VEGF处理24 h;将VEGF组培养的细胞分为4个亚组,分别将阴性对照(miR-NC)、miR-338-3p拟似物、miR-338-3p拟似物+pcDNA、miR-338-3p拟似物+pcDNA-TCF4转染至脉络膜微血管内皮细胞后用VEGF处理24 h。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测细胞中miR-338-3p和TCF4相对表达量;采用MTT法检测细胞增生率以评估细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;行双荧光素酶报告实验验证miR-338-3p与TCF4的靶向关系;采用Western blot法检测细胞中增生标记蛋白细胞增生核抗原-67(Ki-67)、增生细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(bax)、B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)蛋白相对表达量。结果与正常对照组比较,VEGF组细胞中miR-338-3p mRNA表达水平显著降低,TCF4 mRNA表达水平显著升高,细胞增生率显著升高,细胞凋亡率显著降低,细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著升高,bax蛋白水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与VEGF+miR-NC组比较,VEGF+miR-338-3p组细胞增生率显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著降低,bax蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-338-3p可靶向结合TCF4;与VEGF+miR-338-3p+pcDNA组比较,VEGF+miR-338-3p+pcDNA-TCF4组细胞增生率显著升高[(56.48±13.20)%vs.(96.24±16.24)%],细胞凋亡率显著降低[(30.59±3.57)%vs.(12.36±1.29)%],细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著升高(0.41±0.11 vs.0.96±0.19;0.44±0.10 vs.0.97±0.20;0.55±0.12 vs.0.98±0.15),bax蛋白表达水平显著降低(0.87±0.13 vs.0.42±0.11),差异均有统计学意义(t=5.700、14.408、7.516、7.111、6.715、7.927,均P<0.01)。结论miR-338-3p过表达可负向调控TCF4在细胞中的表达量,从而抑制脉络膜微血管内皮细胞的增生及诱导细胞凋亡。

MiR-485-3p对IgA肾病的诊断价值及其与免疫学指标和T淋巴细胞亚群的相关性

目的探讨miR-485-3p对IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)的诊断价值及其与IgA/C3、CD4~+/CD8+的相关性。方法选取2018年1月至2020年12月三亚中心医院收治的IgAN患者106例(IgAN组)、非IgAN原发性肾小球肾炎患者90例(非IgAN组)和体检健康者50名(对照组)。检测各组miR-485-3p、免疫学指标(IgA、IgG、IgM、C3、C4、IgA/C3)以及T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平。应用多因素Logistic回归分析影响IgAN发生的危险因素,绘制受试者工作特征(receiver operating fharacteristic curve,ROC)曲线分析miR-485-3p、IgA/C3及CD4+/CD8+诊断IgAN的价值。采用Pearson相关分析miR-485-3p表达水平与IgA、IgG、IgM、C3、C4、IgA/C3、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的相关性。结果IgAN组miR-485-3p(0.48±0.06比1.20±0.25,1.96±0.73)、CD4+[(31.46±6.82)%比(42.15±8.40)%(47.50±9.35)%]及CD4+/CD8+(1.02±0.46比1.50±0.71,1.63±0.58)水平明显低于非IgAN组和对照组(P<0.001)。IgAN组IgA[(3.16±1.18)g/L比(2.05±0.73)g/L,(1.24±0.46)g/L]及IgA/C3(2.94±1.05比1.81±0.86,1.13±0.52)水平明显高于非IgAN组和对照组(P<0.001)。多因素Logistic回归分析,结果显示24 h尿蛋白定量、IgA/C3水平高以及估算肾小球滤过率、CD4+/CD8+、miR-485-3p水平低是影响IgAN发生的危险因素(P<0.05)。ROC曲线结果显示,血清miR-485-3p表达水平诊断IgAN的曲线下面积(area undre the curve,AUC)为0.862(95%CI:0.803~0.922),其联合IgA/C3及CD4+/CD8+诊断IgAN的AUC高达0.937(95%CI:0.878~0.995),敏感度为96.3%,特异度为84.2%。相关分析显示,IgAN组血清miR-485-3p表达水平与IgA、IgA/C3呈负相关(r=-0.753、-0.827,P<0.05),与CD4+、CD4+/CD8+呈正相关(r=0.435、0.692,P<0.05)。结论miR-485-3p在IgAN患者中呈低表达,与IgA/C3及CD4+/CD8+具有相关性,三项联合诊断IgAN的价值较高。

肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制研究

目的:探究肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制。方法:将16HBE exo、A549 exo、H522 exo、H460 exo、miR-NC exo、miR-24-3p exo与CD8^(+)T细胞共孵育(16HBE exo组、A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组、miR-NC exo组、miR-24-3p exo组),与PBS共孵育组(PBS组)作为对照,CD8^(+)T与miR-24-3p exo共孵育后转染FGF11质粒(miR-24-3p exo+FGF11组)。CCK8法检测CD8^(+)T细胞的增殖能力。双荧光素酶报告基因实验验证miR-24-3p和FGF11的靶向关系。将各组CD8^(+)T细胞与A549细胞以20∶1的比例共孵育4 h(16HBE exo/CD8^(+)T组、A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组、miR-NC exo/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo/CD8^(+)T组、PBS/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组),Elisa检测共孵育后细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度,LDH法检测CD8^(+)T细胞对A549细胞的杀伤能力。结果:相比于PBS组,A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度显著下降(P<0.001),CD8^(+)T细胞杀伤能力亦显著下降(P<0.001)。双荧光素报告基因检测结果显示FGF11为miR-24-3p的靶基因。miR-24-3p exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著低于miR-NC exo组,miR-24-3p exo+FGF11组CD8^(+)T细胞增殖能力显著高于miR-24-3p exo组(P<0.05)。miR-24-3p exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力均显著低于miR-NC exo/CD8^(+)T组(P<0.001), miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力显著高于miR-24-3p exo/CD8^(+)T组(P<0.001)。结论:肺癌细胞外泌体miR-24-3p可通过靶向抑制FGF11而抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤功能。

非酒精性脂肪性肝炎患者外周血T淋巴细胞中miR-221-3p、ANXA1的表达

目的探究非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者外周血T淋巴细胞中miR-221-3p、膜联蛋白A1(ANXA1)表达及意义。方法选取收治的128例NASH患者为NASH组,同期128名健康体检者为健康对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外周血T淋巴细胞中miR-221-3p、ANXA1 mRNA表达水平;分析miR-221-3p、ANXA1 mRNA表达与血脂水平、肝功能及肝组织炎症和肝纤维化程度的相关性;分析NASH发生的影响因素。结果NASH组miR-221-3p表达水平及体质指数(BMI)、腰臀比(WHR)、收缩压、舒张压、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、血糖(GLU)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)显著高于健康对照组,ANXA1 mRNA表达水平及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血小板(PLT)显著低于健康对照组(P<0.05)。NASH组患者miR-221-3p表达水平与TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT及肝组织炎症和肝纤维化程度呈正相关(P<0.05),与HDL-C、ANXA1 mRNA呈负相关(P<0.05);ANXA1 mRNA表达水平与TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT及肝组织炎症和肝纤维化程度呈负相关(P<0.05),与HDL-C呈正相关(P<0.05)。BMI、舒张压、HOMA-IR、ALT、GGT、TG、LDL-C、miR-221-3p是NASH发生的影响因素(P<0.05),ANXA1是其保护因素(P<0.05)。结论NASH患者外周血T淋巴细胞中miR-221-3p呈高表达,ANXA1呈低表达,检测其表达对评估患者病情有一定参考价值。

重症急性胰腺炎病人外周血微RNA-143-3p、环氧合酶-2表达水平与辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的关系

目的探究重症急性胰腺炎(SAP)病人血清微RNA-143-3p(miR-143-3p)、环氧合酶-2(COX-2)表达水平与辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的关系。方法选取2017年12月至2020年9月榆林市第一医院诊治的103例急性胰腺炎(AP)病人进行研究,按APACHEⅡ评分将其分为SAP组(45例)和轻症急性胰腺炎(MAP)组(58例),另选取同期55例体检健康者为健康组。比较各组血清miR-143-3p、维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)mRNA、COX-2 mRNA、叉头/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平;分析SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相关性;分析SAP发生的影响因素。结果MAP组、SAP组病人血清miR-143-3p(0.70±0.23、0.42±0.14比1.04±0.35)、Foxp3 mRNA表达水平(0.56±0.19、0.31±0.11比1.03±0.34)及Treg细胞百分比[(6.13±2.04)%、(2.73±0.90)%比(8.74±2.91)%]低于健康组(P<0.05),COX-2 mRNA(1.68±0.48、2.37±0.54比1.01±0.34)、RORγt mRNA表达水平(1.72±0.57、2.44±0.81比1.05±0.35)及Th17细胞百分比[(3.87±1.29)%、(6.71±2.34)%比(1.99±0.66)%]、Th17/Treg(0.63±0.21、2.46±0.82比0.23±0.08)高于健康组(P<0.05);SAP组病人血清miR-143-3p、Foxp3 mRNA表达水平及Treg细胞百分比低于MAP组(P<0.05),COX-2 mRNA、RORγt mRNA表达水平及Th17细胞百分比、Th17/Treg高于MAP组(P<0.05);SAP病人血清miR-143-3p表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清COX-2 mRNA表达水平与Treg、Foxp3 mRNA呈负相关(P<0.05),血清miR-143-3p表达水平与Treg、Foxp3 mRNA及血清COX-2 mRNA表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相关(P<0.05);SAP病人血清miR-143-3p表达水平与COX-2 mRNA呈负相关(P<0.05);miR-143-3p是影响SAP发生的保护因素(P<0.05),COX-2 mRNA、Th17/Treg是影响SAP发生的危险因素(P<0.05)。结论SAP病人血清miR-143-3p表达水平较低,COX-2 mRNA表达水平较高,二者均与Th17/Treg平衡相关,miR-143-3p可能为治疗SAP的新靶点。

miR-218-2-3P靶向SIN3A基因影响NK/T细胞淋巴瘤的增殖和凋亡

目的·探讨miR-218-2-3P在NK/T细胞淋巴瘤中的表达情况,及其通过靶向SIN3A基因对NK/T细胞淋巴瘤增殖、凋亡及周期的影响。方法·采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测miR-218-2-3P在正常人NK细胞和NK/T细胞淋巴瘤细胞NK92MI、NKYS中的表达。采用脂质体3000瞬时转染法向NK92MI细胞分别转染含无义序列的抑制剂(inhibitor NC)、miR-218-2-3P抑制剂(mi R-218-2-3P inhibitor)及不含片段的转染试剂,并采用qPCR和蛋白质印迹法(Western blotting)分别检测上述3组即inhibitor NC组、miR-218-2-3P inhibitor组及空白对照组细胞中miR-218-2-3P及SIN3A蛋白的表达水平。通过CCK8法检测3组细胞的增殖活力。利用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率和周期。采用双荧光素酶报告基因实验检测SIN3A是否为miR-218-2-3P的靶基因。向NK92MI细胞分别转染mi R-218-2-3P inhibitor+SIN3A干扰小RNA(si-SIN3A)、miR-218-2-3P inhibitor+含无义序列的干扰小RNA(si-NC),并采用CCK8法检测该2组细胞的增殖活力。结果·与正常人NK细胞相比,NK92MI细胞、NKYS细胞中miR-218-2-3P的表达显著升高(均P<0.05)。与空白对照组和inhibitor NC组相比,miR-218-2-3P inhibitor组NK92MI细胞的增殖活力减弱(均P<0.05)、凋亡率增加(均P<0.05)且发生了G0/G1期细胞周期阻滞(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示SIN3A为miR-218-2-3P的靶基因。与空白对照组和inhibitor NC组相比,miR-218-2-3P inhibitor组的SIN3A蛋白表达水平升高(均P<0.05)。下调SIN3A表达,能够恢复由转染miR-218-2-3P inhibitor减弱的细胞增殖活力(均P<0.05)。结论·miR-218-2-3P在NK92MI、NKYS细胞株中表达较高,其可能通过靶向调控SIN3A对NK/T细胞淋巴瘤的增殖、凋亡及周期产生影响。

过敏性鼻炎患儿血清miR-124-3p和GATA3表达水平与疾病严重程度、Th1/Th2平衡的关系

目的探讨过敏性鼻炎(AR)患儿血清微RNA-124-3p(miR-124-3p)、GATA结合蛋白3(GATA3)表达与患儿疾病严重程度、Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)/Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)平衡的相关性。方法选择2020年6月至2022年4月在江苏省无锡市妇幼保健院(以下简称“我院”)儿童保健耳鼻喉科确诊的AR患儿87例为观察对象(AR组),按症状严重程度分为轻度组53例、中重度组34例,另选取同期在我院健康体检儿童85例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清miR-124-3p表达水平,流式细胞术检测Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2,采用酶联免疫吸附法检测血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素12(IL-12)、IL-4、IL-5、IL-10、GATA3水平,Pearson法分析AR患儿血清miR-124-3p表达与GATA3相关性,mi R-124-3p、GATA3与Th1/Th2及细胞因子相关性。结果AR组血清mi R-124-3p表达水平低于对照组,GATA3水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中重度组血清mi R-124-3p表达水平低于轻度组,GATA3水平高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。AR组Th1细胞比例和Th1/Th2比值低于对照组,Th2细胞比例高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。AR组血清IFN-γ、IL-12水平低于对照组,IL-4、IL-5、IL-10水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,AR患儿血清miR-124-3p表达水平与GATA3水平呈负相关(r<0,P<0.05)。miR-124-3p与Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12呈正相关(r>0,P<0.05),与Th2、IL-4、IL-5、IL-10呈负相关(r<0,P<0.05);GATA3与Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12呈负相关(r<0,P<0.05),与Th2、IL-4、IL-5、IL-10呈正相关(r>0,P<0.05)。结论AR患儿血清mi R-124-3p表达水平降低,GATA3水平升高,与患儿疾病严重程度和Th1/Th2失衡有关。

LncRNA TBX5-AS1靶向miR-92a-3p调控结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究

目的探讨长链非编码RNA T-box转录因子5反义RNA 1(LncRNA TBX5-AS1)对结直肠癌细胞生物学行为的影响及其可能作用机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测结直肠癌组织、癌旁组织中TBX5-AS1和miR-92a-3p的表达量。体外培养人结直肠癌细胞HCT116,分别将TBX5-AS1过表达载体(pcDNA-TBX5-AS1)及其对照空载体(pcDNA)、miR-92a-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-92a-3p)及其阴性对照(anti-miR-NC)、miR-92a-3p寡核苷酸模拟物(miR-92a-3p mmics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、pcDNA-TBX5-AS1与miR-92a-3p mimics转染至HCT116细胞。MTT法、平板克隆形成实验、划痕实验与Transwell小室实验分别检测细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告基因实验检测TBX5-AS1和miR-92a-3p的靶向关系。结果与癌旁组织比较,结直肠癌组织中TBX5-AS1的表达量降低,miR-92a-3p的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。转染pcDNA-TBX5-AS1或转染anti-miR-92a-3p后细胞活力降低,克隆形成数和侵袭细胞数减少,迁移距离缩短,差异均有统计学意义(P<0.05)。TBX5-AS1可靶向调控miR-92a-3p;转染miR-92a-3p mmics后细胞活力升高,克隆形成数和侵袭细胞数增多,迁移距离增加,差异有统计学意义(P<0.05)。共转染pcDNA-TBX5-AS1与miR-92a-3p mmics能够逆转pcDNA-TBX5-AS1对HCT116细胞生物学行为的作用。结论TBX5-AS1过表达可通过抑制miR-92a-3p的表达,减弱结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。

基于微小RNA-142-3p与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的相互作用探讨细胞因子在原因不明反复性流产的作用

目的探讨原因不明反复性流产(URSA)过程中微小RNA-142-3p(miR-142-3p)与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的相互作用对细胞因子影响的可能机制。方法选取2016年9月至2017年12月中国科学院大学深圳医院(光明)收治的45例URSA患者纳入流产组,选取同期于中国科学院大学深圳医院(光明)进行检查的40例健康早孕者作为对照组进行回顾性研究。采用流式细胞仪检测两组研究对象外周血中CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞百分比,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Th1型细胞因子与Th2型细胞因子的表达水平。结果流产组研究对象CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞百分比低于对照组(P<0.05);流产组研究对象外周血中白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-4(IL-4)的表达水平低于对照组(P<0.05),而白细胞介素-2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的表达水平均高于对照组(P<0.05);流产组研究对象的IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4比值均高于对照组(均P<0.05);荧光素酶报告基因检测显示,miR-142-3p与CTLA-4具有较强的结合能力。结论miR-142-3p对CTLA-4的表达具有潜在的抑制作用,这可能是促使URSA的机制之一。

铅(Ⅱ)与T(3-HP)P显色反应的研究及其应用

该文研究了用新合成的显色剂meso-四(3-羟基苯基)卟啉(简称T(3-HP)P)吸光光度法测定微量元素铅的显色反应条件及应用。在pH10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中,在沸水浴中加热3分钟,当存在双氧水和TritonX-100时,该试剂与铅有灵敏的显色反应,配合物在466nm处有最大吸收,表观摩尔吸光系数ε=1.52×105L/(mol·cm),铅含量在0～12μg/25ml内呈线性。该反应体系稳定,灵敏度较高,已成功用于实际样品的测定。

妊娠糖尿病母鼠胎儿心脏组织CD4^+ T细胞水平表达及相关机制研究

目的探讨分析妊娠糖尿病母鼠胎儿心脏组织CD4+T细胞水平表达及其相关机制。方法将怀孕的84只雌性SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)和STZ诱导的妊娠糖尿病模型组(gestational diabetes mellitus,GDM组),免疫组化检测不同组别胎鼠心脏组织中CD4^+T细胞水平,Western blotting检测IL-17、IL-4、Tim-3、PD-1表达,RT-PCR检测miR-223-3p表达。结果GDM组CD4^+CD25^+Treg阳性细胞表达数量[(46.41±10.94)%]低于NC组[(21.63±10.94)%],差异有统计学意义(P<0.01)。GDM组IL-17、Tim-3及PD-1表达量均高于NC组,而IL-4低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。GDM组miR-233-3p相对表达量(0.682±0.104)低于NC组(0.466±0.117),差异有统计学意义(P<0.05)。结论GDM子鼠心脏组织异常可能与CD4^+T细胞表达下降有关,而这一作用机制可能与胎鼠心脏组织中miR-233-3p表达下调及其介导的炎症反应有关。

miR-155-3p对HANK1细胞EAF1 mRNA降解速率及恶性增殖的影响

目的:探究miR-155-3p对人NK/T细胞淋巴瘤细胞HANK1恶性行为的影响及潜在机制。方法:Targetscan数据库预测miR-155-3p的靶基因,培养对数生长期HANK1细胞,将细胞分为空白组、过表达组、对照组及干扰组,利用细胞转染技术依次转入pENTER-puro空白载体、pENTER-miR-155-3p过表达载体、GV248对照载体、GV248-miR-155-3p siRNA干扰载体。同时放线菌素D(ActD)处理各组细胞,实时荧光定量PCR技术检测各组细胞miR-155-3p、EAF1、β-catenin及c-Myc的表达水平,并分析各组细胞ActD处理后EAF1 mRNA降解速率(n=5),Western blot检测细胞EAF1、β-catenin及c-Myc蛋白表达情况(n=3),CCK-8检测细胞恶性增殖能力变化(n=5)。结果:与空白组相比,过表达组细胞miR-155-3p、β-catenin及c-Myc表达水平显著增高,EAF1表达水平降低且EAF1 mRNA半衰期缩短,细胞恶性增殖能力增强(P均<0.05);与对照组相比,干扰组细胞miR-155-3p、β-catenin及c-Myc表达水平显著降低,EAF1表达水平升高且EAF1 mRNA半衰期延长,细胞恶性增殖能力降低(P均<0.05)。结论:miR-155-3p可促进EAF1 mRNA降解及HANK1细胞恶性增殖能力。

桥本甲状腺炎患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p水平与甲状腺功能和Th1/Th2及Th17/Treg细胞平衡的关系

目的:探讨桥本甲状腺炎(HT)患者外周血微小核糖核酸(miRNA)-142-3p、miR-125a-5p水平与甲状腺功能和辅助性T细胞(Th)1/Th2及Th17/调节性T细胞(Treg)细胞平衡的关系。方法:选取2020年1月~2023年8月我院收治的HT患者90例作为HT组和同时间段90名体检健康者作为对照组,根据甲状腺功能减低程度将HT患者分为甲状腺功能正常组(26例)、亚临床甲状腺功能减退组(31例)和临床甲状腺功能减退组(33例)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测外周血miR-142-3p、miR-125a-5p水平,酶联免疫吸附法检测甲状腺功能指标[甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT_(3))、游离甲状腺素(FT_(4))],流式细胞术检测外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例,并计算Th1/Th2及Th17/Treg比值。通过Pearson/Spearman相关性分析HT患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p与甲状腺功能、Th1、Th2、Th17、Treg的相关性。结果:HT组外周血miR-142-3p、miR-125a-5p、TgAb、TPOAb、TSH、Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg比值高于对照组,FT3、FT4、Th2、Treg比例低于对照组(P<0.05)。甲状腺功能正常组、亚临床甲状腺功能减退组、临床甲状腺功能减退组外周血miR-142-3p、miR-125a-5p、TgAb、TPOAb、TSH、Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg比值依次升高,FT3、FT4、Th2、Treg比例依次降低(P<0.05)。Pearson/Spearman相关性分析显示,HT患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p与TgAb、TPOAb、TSH、Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg呈正相关,与FT3、FT4、Th2、Treg呈负相关(P<0.05)。结论:HT患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p水平升高,与甲状腺功能减退和Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡有关。

miR-140-3p.2靶向PD-L1表达增强CD8^(+)T细胞对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探究miR-140-3p.2靶向程序性死亡受体配体1(PD-L1)表达对细胞毒性T细胞(CD8^(+)T细胞)杀伤肝癌细胞的影响。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting检测L-02和HepG2、Hep3B、HuH-7细胞系中miR-140-3p.2和PD-L1 mRNA和蛋白水平;Targetscan数据库预测miR-140-3p.2和PD-L1的结合位点,并利用双荧光素酶实验进行验证;HepG2细胞分为过表达miR-140-3p.2(miR-140-3p.2)组及其对照(miR-NC)组、过表达PD-L1(PD-L1)组及其对照(NC)组、过表达miR-140-3p.2和PD-L1(miR-140-3p.2+PD-L1)组、过表达miR-140-3p.2和PD-L1对照(miR-140-3p.2+NC)组;qRT-PCR、Western blotting实验分别检测各组细胞中miR-140-3p.2和PD-L1 mRNA和蛋白水平。30只裸鼠分为过表达miR-140-3p.2(miR-140-3p.2)组及其对照(miR-NC)组,每组各15只,采用sc过表达miR-140-3p.2及其对照(miR-NC)的HepG2细胞制备移植瘤模型;检测肿瘤质量及体积;分离裸鼠脾脏组织CD8^(+)T细胞,并与各转染HepG2细胞共培养,细胞毒性实验检测细胞裂解率,ELISA法检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)水平;ELISA法检测移植瘤中TNF-α、IFN-γ水平,流式细胞术检测移植瘤中CD8^(+)T细胞浸润情况。结果 与L-02细胞相比,HepG2、Hep3B、HuH-7细胞中miR-140-3p.2水平降低,PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-140-3p.2组细胞中miR-140-3p.2水平升高,PD-L1 mRNA和蛋白水平降低,细胞裂解率升高,细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.05);与NC组相比,PD-L1组细胞中miR-140-3p.2水平降低,PD-L1 mRNA和蛋白水平升高,细胞裂解率降低,细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.05);过表达PD-L1能部分逆转过表达miR-140-3p.2对上述指标的影响(P<0.05)。裸鼠成瘤4周后,与miR-NC组相比,miR-140-3p.2组移植瘤体积和质量明显减小(P<0.05),移植瘤中miR-140-3p.2水平明显升高、PD-L1 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05),CD8^(+)T细胞浸润水平明显升高(P<0.05),TNF-α、IFN-γ水平明显升高(P<0.05)。结论 miR-140-3p.2靶向PD-L1表达增强CD8^(+)T细胞对肝癌细胞的杀伤作用。