水稻线粒体tRNA^(Trp)突变体的克隆和氨酰化活力鉴定

为了研究tRNATrp的氨基酸接受茎中除两对半碱基以外的特异性元件,设计并完成了4种水稻线粒体tRNATrp向枯草杆菌tRNATrp的突变体(MPB0,G1A和U5G/A68C;MPB1,C2G/G71C;MPB2,C4G/G69C;MPB3,C2G/G71C和C4G/G69C),体外转录并用枯草杆菌和人这两种不同种属来源的色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)测定了这些tRNATrp分子的氨酰化活力(Kcat/KM).结果表明,这些突变体具有被枯草杆菌TrpRS氨酰化的能力,与野生型水稻线粒体tRNATrp相比,MPB0被枯草杆菌TrpRS氨酰化的活力提高了5倍,MPB1和MPB2被枯草杆菌TrpRS氨酰化的活力分别提高了40和53倍,MPB3则提高了140倍,为野生型枯草杆菌tRNATrp的34%,而人色氨酰tRNA合成酶氨酰化这4个突变体的活力都很微弱.揭示了水稻线粒体tRNATrp氨基酸接受茎上的2个碱基对C2/G71和C4/G69的突变,对枯草杆菌TrpRS的识别起重要作用,由此推测,接受茎上的2个碱基对C2/G71和C4/G69也是线粒体tRNATrp重要的特异性元件.

tRNA^(Trp)的种属特异性元件

通过同源性比较原核、古核和真核生物tRNA^(Trp)的核苷酸序列表明tRNA^(Trp)的种属特异性元件可能存在于氨基酸接受茎、D茎、反密码茎以及识别位碱基等处。设计并完成了tRNA^(Trp)的突变,体外转录及原核、真核两种不同来源的色氨酰tRNA合成酶对tRNA^(Trp)及其突变体的测活以确定tRNA^(Trp)的种属特异性元件,进一步揭示tRNA^(Trp)及其合成酶之间的精确识别和共进化过程。原核野生型tRNA^(Trp)其接受茎突变成真核相应的核苷酸后失去了被原核色氨酰tRNA合成酶氨酰化的活力,却被赋予了真核合成酶的氨酰化活力。反密码茎、D茎对于氨酰化活力则影响细微。结果表明tRNA^(Trp)的种属特异性元件主要位于接受茎部位,即氨基酸接受茎和识别位碱基处。研究结果对于tRNA进化及药物的设计具有重要的意义。

3种水稻线粒体tRNA^(Trp)突变体的克隆和活力鉴定

设计并完成了 3种水稻线粒体tRNATrp的突变 ,体外转录并用枯草杆菌和人色氨酰tRNA合成酶 (TrpRS)对tRNATrp及其突变体进行了活力测定 .3种突变体的氨酰化活力比野生型水稻线粒体tRNATrp分别上升了 1 8、1 5和 5倍 .说明A1 U72和G5 C68对于提高线粒体tRNATrp被细胞质TrpRS氨酰化能力的作用并不大 ,细胞质tRNATrp与细胞质TrpRS的识别方式并不适用于线粒体tRNATrp与细胞质TrpRS的相互识别 .

7个水稻线粒体tRNA^(Trp)突变体的克隆和活力测定

为了研究tRNAs被相应的氨酰酶识别的种属特异性,构建了7个水稻线粒体tRNATrp3个碱基(G73,U72,A68)的单点或多点突变的突变体.突变基因,经体外转录后分别用枯草杆菌(B.subtilis)和人色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)进行氨酰化反应,并测定动力学常数.结果表明:与野生型水稻线粒体tRNATrp相比,7个突变体的转录产物被B.subtilisTrpRS氨酰化的活力分别下降了53.33%～99.79%;被人TrpRS氨酰化的活力则提高了4～330倍,其中以pMPH7的氨酰化活力改变最大.识别位碱基G73,G1/U72,U5/A68对水稻线粒体tRNATrp的种属特异性识别起重要作用.

水稻线粒体tRNA^(Trp)种属特异性元件研究

为了研究水稻线粒体tRNATrp的种属特异性元件,在野生型水稻线粒体tRNATrp的基础上,设计并完成了3种向人tRNATrp的突变,体外转录并用枯草杆菌和人这两种不同种属来源的色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)测定了这些tRNATrp分子的氨酰化活力(Kcat/KM).结果表明,与野生型水稻线粒体tRNATrp相比,3个突变体被人TrpRS氨酰化的活力分别提高了354、407和803倍,其中以PMPH3(水稻线粒体tRNATrp的氨基酸接受茎的C2-G71和G3-C70都突变为人tRNATrp的氨基酸接受茎的相应部位)的氨酰化活力改变最大.而3个突变体对B.subtilisTrpRS氨酰化活力有进一步负影响,氨酰化活力微弱.说明水稻线粒体tRNATrp氨基酸接受茎上的第2个碱基对C2-G71和第3个碱基对G3-C70在人色氨酰-tRNA合成酶识别过程中有着极为重要的作用,是水稻线粒体tRNATrp的种属特异性元件.

紫癜灵对慢性免疫性血小板减少症患者Trp代谢的影响

目的:观察紫癜灵对慢性免疫性血小板减少症(ITP)阴虚血热证患者吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)/色氨酰-t RNA合成酶(TTS)介导的色氨酸(Trp)代谢途径的影响。方法:选取健康志愿者(正常对照组)与慢性ITP阴虚血热证患者(患者组)各20例。正常对照组不做任何处理,慢性ITP阴虚血热证患者采用紫癜灵治疗。治疗前后分别采集患者的肝素抗凝血标本,检测CD4+及CD8+T淋巴细胞中IDO、TTS表达及血浆Trp、Kyn浓度。结果:完全反应10例,有效7例,无效3例,有效率85.0%。患者组治疗前CD4+、CD8+T淋巴细胞IDO的平均荧光强度低于正常对照组(P<0.05),TTS的平均荧光强度高于正常对照组(P<0.05)。治疗后,患者组CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO的平均荧光强度较治疗前上升(P<0.05),TTS的平均荧光强度较治疗前下降(P<0.05)。患者组治疗前血浆Trp及Kyn浓度均高于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后,患者组Trp浓度较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);Kyn浓度较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:紫癜灵可能通过影响慢性ITP阴虚血热证患者体内IDO/TTS介导的Trp代谢途径发挥其治疗作用。