Production of Transgenic Tall Fescue Plants with Enhanced Stress Tolerances by Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation

In order to improve stress tolerances of turf-type tall fescue （Festuca arundinacea Schreb.）, Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 carrying plasmid pCMD containing stress tolerance-related CBF1 gene from Arabidopsis thaliana was used to transform mature seeds-derived embryogenic calli of four cultivars. A total of 112 transgenic plants were regenerated from 32 independent lines and verified by histochemical detection of GUS activity, PCR assay and Southern hybridization analysis. The transformation frequency ranged from 0.92 to 2.87% with apparent differences among the cultivars. Stress tolerances of transgenic plants were enhanced, which was shown by the facts that transgenic plants had distinct growth superiority and significantly higher survival rate than non-transformed ones under high salinity and high osmosis stresses, and that relative electronic conductivity of in vitro leaves treated with low and high temoeratures, dehvdration and high salinity stresses was 25-30% lower in transgenic plants than in control plants.In addition,it was observed that growth of transgenic plants was inhibited due to constitutive overexpression of CBF1 gene under normal environmental conditions.

根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株

为改良草坪型高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的耐逆性,以成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐逆相关CBF1基因导入4个供试品种的基因组,经GUS染色、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得了112株转基因植株,转化频率为0.92%～2.87%,不同品种间存在差异.试验表明,在高盐与高渗胁迫下,转基因植株具有显著生长优势,存活率极显著高于非转化对照植株,经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率平均较对照植株低25%～30%,证明转基因植株的耐逆性有所增强.考察发现,非胁迫条件下CBF1基因的组成型超表达使转基因植株的生长受到抑制.

抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响

研究了两种常用抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长和分化的影响 ,结果表明 ,头孢霉素明显抑制愈伤组织生长 ,而浓度低于 5 0 0mg L的羧苄青霉素能促进愈伤组织生长 ;两种抗生素对愈伤组织分化均有抑制作用 ,但羧苄青霉素的抑制作用要比头孢霉素小。因此 ,在农杆菌介导高羊茅遗传转化中 ,抑菌剂以选用羧苄青霉素较为合适。

盐胁迫对高羊茅生长及抗氧化系统的影响

研究了不同浓度NaCl(0,50,100,200,300mmol/L)胁迫对高羊茅生长及抗氧化系统的影响。结果表明,中、低浓度(50,100mmol/L)盐胁迫下,高羊茅生物量和MDA含量与对照组相比没有显著变化;高浓度(200,300mmol/L)盐胁迫后,生物量明显降低,MDA含量显著升高。抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性随着盐胁迫时间的延长先上升后下降,盐浓度越高3种酶活性下降幅度越大。盐胁迫初期,除类胡萝卜素含量略有上升外,GSH和还原型AsA均有不同程度的下降,随着胁迫时间的延长,3种抗氧化物质含量逐渐降低,200,300mmol/L盐处理下降明显。

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。

添加酶和乳酸菌制剂对西藏苇状羊茅和箭筈豌豆混合青贮发酵品质的影响

为评价添加酶、乳酸菌制剂和酶+乳酸菌制剂对苇状羊茅与箭筈豌豆(7∶3)混合青贮发酵品质的影响,试验设对照组(C)、酶制剂(E)、乳酸菌制剂(LAB)和酶+乳酸菌制剂(E+LAB)4个处理,3个重复,青贮后第7,24,60天开窖取样,测定青贮饲料发酵品质。结果表明,与对照组相比,添加酶或乳酸菌制剂能有效地改善混合青贮发酵品质,组合添加进一步提高了乳酸含量和降低了pH值。与对照组和单独添加乳酸菌组相比,在整个青贮过程中无论是酶单独添加还是组合添加都显示较高的乙酸和总挥发性脂肪酸含量,最高的水溶性碳水化合物含量和最低的氨态氮/总氮。这说明酶和乳酸菌制剂组合添加对改善青贮发酵品质有叠加效应。综上所述,酶和乳酸菌制剂组合添加能更好的改善苇状羊茅和箭筈豌豆混合青贮的发酵品质。

高羊茅DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

DREB转录因子是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关的反式作用因子。为了分离和鉴定高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)DREB转录因子基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,用拟南芥DREB1A基因作探针筛选该文库得到一个DREB类基因FaDREB1。序列分析表明,FaDREB1具有一个651bp的开放阅读框和229bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域。酵母单杂交结果表明FaDREB1蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能。Northern杂交结果发现FaDREB1基因受低温的诱导表达,对高盐、干旱和ABA没有反应,说明FaDREB1基因在高羊茅植株对低温的应答反应中起重要作用。

高羊茅辐射敏感性和辐照处理对其成熟种子愈伤诱导的影响

无菌培养条件下发芽率、成苗率、苗高和根长的测定结果表明 ,4个高羊茅品种的辐射敏感性差异很大 ,美洲虎 3号和可奇思对辐射比较敏感 ,半致死剂量大约在 1 5 0Gy左右 ,凌志和猎狗 5号的辐射敏感性分别中等和较弱。用低剂量γ射线处理可促进高羊茅成熟种子的愈伤形成 ,而且诱导愈伤中胚性愈伤的比例有一定提高。因此 ,成熟种子辐照处理可作为提高高羊茅组培效率的一种辅助手段。

施磷对越冬期高羊茅生长、养分吸收及抗寒性的影响

为给华中地区冷季型草坪草养分护理提供依据,在武汉布置试验研究磷肥对冷季型草坪草高羊茅（Festuca arundinaces Schreb.）越冬期生长、养分吸收和抗寒性的影响。结果表明：在氮钾肥基础上增施磷肥（P2O5 5～25 g/m^2）显著促进草坪草生长和品质改善,与对照相比,各施磷处理越冬期分蘖数、株高、叶面积、地上部生物量、叶片叶绿素含量（SPAD）均有显著地提高;显著提高草坪草地上部氮、磷、钾含量,促进养分吸收;叶片脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量随磷肥施用而显著下降,明显降低低温对高羊茅的伤害程度;磷肥的适宜用量范围为10～15 g/m^2,过低或过高用量磷肥均会对草坪草生长、质量及抗寒性产生不良影响。

高羊茅CBF转录激活因子基因片段的克隆

根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计 1对特异引物 ,采用PCR方法从高羊茅基因组中扩增出 1个DNA片段并克隆到pUCm T载体中。经序列测定和分析 ,该片段长 60 8bp ,与 3个拟南芥CBF基因的核苷酸及其推导氨基酸序列分别具有 81～ 84%和 75～ 79%的同源性 ,而且推导氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2DNA结合域以及CBF蛋白的两段特征序列PKK RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。这些结果表明 。

不同缓控释氮肥对高羊茅草坪生长及氮素挥发的影响

通过田间试验,研究了氮释放期为30和60d的树脂包膜尿素(PCU30、PCU60),硫包衣尿素(SCU),抑制剂型缓释尿素(UI)和普通尿素(U)对高羊茅草坪生长、氮素吸收及氮素挥发的影响。结果表明,在全年施氮量260kg/hm2的情况下,PCU30、PCU60和SCU一年分春秋2次施用可以满足高羊茅草坪正常生长需要,其草屑累积量和氮素吸收量显著高于普通尿素一年4次施用处理;氮素气态损失方面,UI处理的氨挥发损失氮量高达44.42kg/hm2,显著高于其他施氮处理,其N2O排放氮量为6.46kg/hm2,显著低于其他施氮处理;PCU30、PCU60、SCU处理的氨挥发量和N2O排放氮量分别为17.67,13.59,18.54kg/hm2和8.14,6.92,9.91kg/hm2,显著低于U处理。综合考虑各种因素,建议高羊茅草坪一年分春秋2次施用树脂包膜尿素PCU60较为适宜,可有效提高肥料利用率、降低氮素挥发损失,环境效益明显。

樟树叶水浸提液对高羊茅种子萌发和幼苗生长的化感作用

试验探讨了不同浓度的樟树[Cinnamomum camphora(L.)Presl]叶水浸提液对草坪植物高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)种子萌发和幼苗生长的化感作用。结果表明,樟树叶水浸提液对受体植物种子的萌发及幼苗生长均有明显的化感抑制作用,且随着水浸提液浓度的升高,抑制效应增强。当水浸提液浓度达到150 mg/mL时,高羊茅种子的发芽率、发芽指数和单株幼苗的苗长、苗鲜重、根长、根鲜重均与去离子水处理的对照差异极显著(P<0.01)。其中对高羊茅种子发芽指数的化感抑制效应高于对发芽率的化感抑制效应;对幼苗生长指标的化感抑制作用强度高低排序依次为根长、苗长、根鲜重、苗鲜重;显示出樟树叶片中含有较强活性和具稳定性的化感物质。

新疆高羊茅成熟过程中种子活力变化的研究

2000～2001年在新疆塔里木农垦大学牧草站,对交战(Crossfire)高羊茅种子不同成熟过程中标准发芽率、老化发芽率、发芽指数、活力指数、浸出液含糖量、ATP含量以及脱氢酶和酸性磷酸脂酶活性进行了研究。结果表明,随着种子的成熟,标准发芽率、老化发芽率、发芽指数、活力指数、ATP含量呈增长的趋势,种子活力逐渐增加。若仅靠一项指标评定种子活力,不够全面。交战高羊茅在盛花期20d以后种子活力相对较高,而且稳定,可适时收获种子。

干热胁迫下两种苇状羊茅对不同水肥处理的响应机理

苇状羊茅是我国过渡区常用的四季常绿草坪草种,但在夏季苇状羊茅受到高温和干旱的双重胁迫。通过研究干热胁迫下不同灌溉与施肥管理措施对2种苇状羊茅品种火凤凰和科纳多的内部生理生化指标、外部形态学指标及草坪质量外观指标的影响,目的在于,1)分析灌溉和施肥管理对2个苇状羊毛品种对干热胁迫抗性的调控,2)通过该项实验筛选出适合在干热胁迫下不同品种的优化水肥管理措施。结果表明,1)不同组合水肥处理下的苇状羊茅2个品种,其抗逆性均有显著提升,MDA含量下降,火凤凰B1C1的MDA含量为16.461μmol/g,火凤凰B2C2为20.386μmol/g,POD活性升高,叶绿素含量上升,从科纳多对照的3.5813mg/g提高到科纳多B1C1的5.206 7mg/g。相对含水量提高,以外部形态而言,分蘖数和叶片数密度提高,适度的干旱胁迫提高了根冠比,浇水和施肥均能显著提高草坪质量。2)品种火凤凰的整体表现要优于科纳多,但差异均不显著。3)灌溉和施肥对干热胁迫下的苇状羊茅各项生理指标的影响均达到显著水平,但水肥间互作效应表现的并不显著。4)从水肥处理的结果来看,B1C1的组合,也就是每周浇水1次和每2周施肥1次,对苇状羊茅的综合抗性有提高调节作用,为最优水肥管理措施。5)苇状羊茅的不同品种对干热胁迫的适应性从地上部分和地下部分发生了分化,这对苇状羊茅的品种选育和夏季水肥管理有着重要的指导意义。

草坪型高羊茅种子活力的研究

对美国俄勒冈州引入的六个种子批的草坪型高羊茅种子用加速老化测定法、电导率测定法、温室出苗测定法、田间出苗测定法和标准发芽测定法进行的种子活力研究表明：不同种子批的活力有明显的差异。标准发芽测定中高发芽率且差异不显著的种子批其加速老化后的发芽率、田间出苗率、电导率都有显著的差异。加速老化后的发芽率、电导率与田间出苗率之间都存在极显著的相关关系。加速老化后的发芽率比标准发芽率测定的发芽率更接近田间出苗率。从高发芽率到低发芽率种子批也表现出种子活力从高到低，但标准发芽测定的发芽率从高到低降低的速度较加速老化后的发芽率和田间出苗率降低的速度缓和的多。各种子批的千粒重与种子活力、种苗芽长和种苗芽重之间不存在极显著的相关关系，但种苗的芽长和芽重在某种程度上受种子大小的影响。

高羊茅成熟种子组织培养的影响因素研究 I.多种因素对愈伤组织诱导的影响

以4个草坪型高羊茅品种的成熟种子为外植体,研究多种因素对愈伤组织诱导的影响。结果表明,增加2,4-D浓度能显著提高高羊茅成熟种子愈伤组织诱导率,而同时辅之以ABA则能获得更好的诱导效果,其最佳组合为8mg/L2,4-D+2mg/LABA;种子灭菌后纵切或切胚可使出愈率成倍提高;采用MS基本培养基和在培养基中添加水解酪蛋白与谷氨酰胺也有助于提高出愈率;诱导培养基中添加BAP在多数情况下导致出愈率降低,但对改善愈伤组织质量有利。

高羊茅成熟种子组织培养的影响因素研究:Ⅱ.不同因素对胚性愈伤组织继代发生的影响

以从4个草坪型高羊茅品种成熟种子直接诱导获得的初始愈伤组织为起始材料，研究3种因素对胚性愈伤组织继代发生的影响。结果表明，继代培养基中添加BAP和硫酸铜以及提高蔗糖浓度均能促进胚性愈伤组织形成，提高胚性愈伤组织频率，其适宜浓度分别为：BAP0．1～0．2mg/L，硫酸铜2．5mg/L，蔗糖60g／L。这3种因素中，又以添加BAP的效果最好，添加硫酸铜次之。4个供试品种间胚性愈伤组织发生能力存在明显差异。

高羊茅中一个DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

为了鉴定草坪草高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)中与低温、高盐和干旱胁迫相关的基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,并从这个文库中分离得到一个DREB类转录因子基因,FaDREB1A.序列分析表明,FaDREB1A具有一个717bp的开放阅读框和143bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域.酵母单杂交结果表明,FaDREB1A蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能.Southern杂交结果显示,FaDREB1A在高羊茅基因组中可能是单拷贝或低拷贝基因.Northern杂交结果发现,FaDREB1A基因受低温、高盐和干旱的诱导表达,对ABA没有反应,说明FaDREB1A基因在高羊茅植株对低温、高盐和干旱的应答反应中起重要作用.

高羊茅成熟胚离体培养及高频植株再生

以高羊茅Festucaarundinacea成熟种子为外植体,采用均匀设计研究了不同生长调节剂、基因型和培养基对愈伤组织诱导的影响。结果表明:2,4D对高羊茅成熟种子萌芽及愈伤组织诱导的影响极大;基因型对愈伤组织诱导有一定影响;培养基对愈伤组织诱导无任何影响;愈伤组织在不添加任何生长调节剂的培养基上即可进行分化。高羊茅最佳愈伤组织诱导培养基组合为N6+18mg/L2,4D,外植体为“王朝”成熟种子的愈伤组织诱导率可达95.6%,且植株分化率达100%。

高羊茅和其他羊茅植株再生与遗传转化研究进展

高羊茅、紫羊茅和草地羊茅均为很重要的多年生冷季型牧草与草坪草,生物技术在其品种改良中具有很大的应用潜力。30年来,三种羊茅的组织培养、胚性培养物的长期保存以及遗传转化等研究取得了较大进展,已建立起多种植株再生体系和遗传转化技术,但作为单子叶植物,这些草种的组织培养和转基因遗传改良也还存在一些问题。本文就以上几方面的内容进行了综述。