目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术在花生属中的应用

花生属分子标记领域的研究远落后于其他物种,而栽培种花生因其遗传基础狭窄,用大多数分子标记技术都难以检测到丰富的分子标记,因此限制了花生属野生种在改良花生栽培种方面的利用以及建立花生分子标记辅助育种技术体系。本文分别对花生属4个区组的16份种质资源和8份花生栽培种资源采用与功能基因相关的SCoT分子标记技术研究了花生属种间和栽培种内遗传多样性和亲缘关系。23条SCoT引物在花生属试材基因组中的扩增位点共194个,其中多态性位点130个,多态性达67.01%,通过聚类分析研究了它们之间的亲缘关系;在栽培种内筛选出19条多态性引物,在8份试材基因组中扩增位点198个,其中多态性位点67个,多态性为33.84%,表明SCoT分子标记技术能在花生栽培种内检测出一定程度的DNA多态性。

贵州桃种质资源遗传多样性的SCoT分析

应用SCoT分子标记技术对71份贵州桃种质进行遗传多样性分析,以期从分子水平上揭示其遗传多样性及资源间的遗传关系,为科学保存与利用贵州桃种质资源提供依据。结果表明：（1）16条引物共检测出192个位点,其中多态性位点数156个,多态性比例为81.25%,平均每条引物扩增位点为12个;供试材料Nei’s遗传多样性指数（H）为0.265 0±0.186 1,Shannon’s信息指数（I）为0.400 3±0.254 3,遗传相似系数变幅为0.400 0-0.852 5。（2）UPGMA聚类分析显示,在相似系数0.65处可将71份桃资源分成6类,其中2份白花桃资源、2份血桃资源、2份青桃资源分别为同名异物。研究认为贵州桃种质具有较丰富的遗传多样性,采用该分子标记技术区分了同名异物的桃资源。

荔枝SCoT-PCR反应体系的建立及其在遗传分析中的应用

建立适于荔枝的SCoT反应体系,并利用SCoT体系对‘紫娘喜’、‘无核荔’及其杂交后代进行真假杂种鉴定和遗传多样性分析。采用正交设计方法对影响荔枝SCoT-PCR反应的rTaq酶、Mg2＋浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物等因素进行体系优化。优化的荔枝SCoT反应体系为：20μL反应体系中含有模板DNA 30 ng,rTaq酶1 U,引物0.75μmol/L,Mg2＋3 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L。最适退火温度为50.6℃。利用该体系对‘紫娘喜’、‘无核荔’及其杂交后代进行遗传分析,结果显示,32条引物共扩增出280个位点,多态性位点有131个,占总位点数46.78%。4条引物就可以将60株杂交后代鉴定出来。UPGMA聚类分析显示,SCoT标记能将30株杂交后代区分开,遗传相似系数在0.406-0.867,在相似系数0.68时,30株杂交后代可聚为3类。优化建立的荔枝SCoT体系结果稳定,重复性好,为荔枝遗传育种提供了新的技术支持。

温郁金SCoT-PCR反应体系的正交优化

以温郁金为试材,运用L25(56)正交设计在5个水平上对影响温郁金SCoT-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶和引物5个因素进行优化试验,对PCR结果进行极差分析。建立并优化温郁金的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系,以期为温郁金的遗传多样性分析及分子鉴定等研究提供技术支持。结果表明:建立了温郁金SCoT-PCR的最佳反应体系(20μL):引物0.8μmol/L,dNTPs 0.4mmol/L,Mg2+1.5mmol/L,Taq酶0.5U,模板DNA 40ng,且确定各因素对温郁金SCoT-PCR反应效果的影响大小依次为:dNTPs>Taq酶>引物>Mg2+>模板DNA,其中dNTPs对体系影响最大。优化的温郁金SCoT-PCR反应体系在多个温郁金品种遗传多样性研究中得到了验证,结果表现出良好的稳定性、重复性和多态性丰富等特点,可用于今后温郁金品种遗传多样性分析、系统发育分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究。

地黄SCoT分子标记体系的建立和指纹图谱的构建

该研究采用L_(25)(5~6)正交设计和单因素两种方法,对影响地黄SCoT-PCR反应的5个因素(模板DNA浓度,引物浓度,ddH_2O和Mix的用量以及退火温度)进行了优化。结果表明:优化后的反应体系总体积为25μL,含有8μL ddH_2O,1μL模板DNA(80 ng·μL^(-1)),1μL引物(8μmol·L^(-1))和15μL Mix,退火温度为45℃。运用30份地黄种质材料,对优化的SCoT-PCR正交体系进行多次重复验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,证明该反应体系稳定可靠。利用该体系对32条SCoT引物进行两次筛选,得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用SCoT_4等5条引物构建了上述地黄2个种共30份种质的SCoT指纹图谱。利用这5个SCoT引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。这表明SCoT分子标记体系适用于地黄主要品种亲缘关系及遗传多样性的研究,所构建的指纹图谱也为地黄常见的7个栽培品种的区分提供参考依据。

甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选

以甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)交配型菌株基因组DNA为模板,在单因素优化试验的基础上,采用L16(45)正交试验设计,对影响甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、r Taq DNA聚合酶和模板用量5个因素进行优化,建立优化的甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系:DNA模板12.50ng、dNTPs 0.17mmol/L、引物0.46μmol/L、Mg2+1.7 mmol/L、r Taq DNA聚合酶0.85U、1×Buffer(Mg2+free),总体积25μL。应用优化体系从30条SCoT引物中筛选扩增条带清晰且多态性丰富的10条引物,并利用这10条引物对10份地理来源和寄主来源不同的甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组DNA进行SCoT标记,结果共扩增出86条带,多态性比率为58.67%,平均每条引物扩增8.60条。UPGMA聚类分析结果表明:在遗传相似系数为0.75的水平上,可将10个菌株分为3类,聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性。

金线莲资源遗传多样性分析及耐热性评价

金线莲(Anoectochilus roburghii)是具有极高经济价值的珍稀濒危兰科药用植物,高温是制约其广泛生产栽培的首要限制因子,选育耐热品种是抵御高温热害最经济有效的措施之一。本研究利用目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术对24份金线莲种质资源进行遗传多样性分析,并利用多元统计分析的方法对其中20份样本进行耐热性评价。遗传多样性分析结果显示:在遗传系数0.602水平上,可以把金线莲种质分成I和II两大类,I类分成A和B两个亚群,台湾金线莲(TJ)与其他资源遗传距离较远,单独归为II类;A亚群中除了W来源于云南,其他均为福建西北部收集的资源;B亚群主要来自闽南地区和广西。通过对20份金线莲资源5个生理参数测定,发现热处理后叶绿素含量和SOD活性明显下降,相对电导率明显升高,而丙二醛和可溶性蛋白含量热处理后各资源表现不一。利用多元统计分析方法进行耐热性初步评价,结果显示,TL、L1、A20、GZ1等4份资源较为耐热,TJ、HX、L、M、A21等5份资源不耐热。

Conservation Strategy for African Medicinal Species: In Vitro Biotechnological Approach

The use of medicinal plants for different therapeutic values is well documented in African continent.African diverse biodiversity hotspots provide a wide range of endemic species,which ensures a potential medicinal value.The feasible conservation approach and sustainable harvesting for the medicinal species remains a huge challenge.However,conservation approach through different biotechnological tools such as micropropagation,somatic embryogenesis,synthetic seed production,hairy root culture,molecular markers based study and cryopreservation of endemic African medicinal species is much crucial.In this review,an attempt has been made to provide different in vitro biotechnological approaches for the conservation of African medicinal species.The present review will be helpful in further technology development and deciding the priorities at decision-making levels for in vitro conservation and sustainable use of African medicinal species.

菊属植物SCoT分子标记技术在遗传多样性分析中的应用

采用正交设计方法,对Mg2+、dNTPs和引物浓度、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量等5个因素进行筛选,得到适于菊属植物的SCoT标记PCR反应体系,25μL体系中含有:Mg2+1.2 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.8μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1 U、模板DNA 50 ng。优化的最适退火温度为49.4℃。改进电泳方法,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法染色。运用不同倍性菊属材料基因组DNA对优化的SCoT-PCR反应体系进行验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明确立的菊属植物SCoT分子标记技术体系稳定可靠。利用该体系及筛选出的12个SCoT引物,对18份菊花近缘种属材料的遗传多样性及亲缘关系进行分析,共检测到209个位点,其中多态性位点数189个,多态性比率为90.43%。应用NTSYS-pc2.1软件,计算菊花近缘种属材料之间的相似性系数并采用不加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析,结果 18份菊花近缘种属材料的遗传相似性系数范围为0.4516～0.7035,平均遗传相似性系数为0.58。聚类分析显示在相似系数0.530处可以将18份材料分成Ⅰ、Ⅱ两个大组,Ⅱ组包括芙蓉菊和绢毛蒿,其余16份材料属于Ⅰ组。Ⅰ组在相似系数0.615水平又分为6个亚组。结果表明SCoT分子标记体系适用于菊属及其近缘属种遗传多样性及亲缘关系的研究。

杜鹃花SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选

本试验以马银花(R.ovatum)DNA为模板,采用L16(45)正交试验对目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系中5因素(Taq聚合酶用量,Mg^(2+)浓度,模板DNA用量,dNTPs浓度,引物浓度)进行了优化,建立了杜鹃花植物SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中,模板DNA 1.00 ng/μL,Mg^(2+)为3.00 mmol/L,dNTPs为0.25 mmol/L,引物为0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶为2.00 U。比较了各因素对反应体系的影响,发现引物物浓度的差异对体系影响显著,各因素影响的先后顺序为引物>Taq DNA聚合酶>dNTPs>Mg^(2+)>模板DNA。并运用了杜鹃属的4个不同种对最优体系进行了稳定性验证,选择了10个通用性的引物进行筛选,发现10个引物均能扩增出条带,其中有6个引物能够得到清晰可辨、多态性丰富的条带。该体系的建立将为杜鹃花遗传多样性、差异基因的表达分析,分子辅助育种、遗传图谱构建等研究提供技术支持。