人tau转基因小鼠模型及其在tau蛋白病研究中的应用

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)和额颞叶痴呆(frontotemporal dementia,FLTD)是最主要的痴呆相关疾病,记忆下降是AD的主要症状,FLTD还伴有行为个性变化。近年来,随着国外转基因小鼠的引入,越来越多的研究者采用转基因小鼠研究痴呆相关疾病。

索马鲁肽对转基因APP/PS1/tau阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响

目的探究索马鲁肽能否有效改善阿尔茨海默病(AD)转基因APP/PS1/tau小鼠的认知功能。方法本研究选用的AD模型小鼠是含有PS1M146V、APPSwe和tauP301L 3个基因突变位点的APP/PS1/tau三重转基因AD小鼠(3×Tg-AD)。7月龄的APP/PS1/tau三重转基因小鼠及同窝非转基因野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠分别随机分为:AD模型组(Tg)和索马鲁肽组(Tg+Semaglutide)、正常对照组(WT)和索马鲁肽对照组(WT+Semaglutide)。WT+Semaglutide组和Tg+Semaglutide组腹腔注射索马鲁肽,WT组和Tg组腹腔注射等量生理盐水,小鼠干预30次,每2 d干预一次。干预结束后进行新物体识别实验研究小鼠认知功能的改变,行ELISA实验检测小鼠血清中与认知相关的标志物Aβ_(1-42)的水平,采用Western blot法检测小鼠海马区Ser231位点磷酸化的Tau蛋白表达。结果新物体识别实验中,与Tg组相比,Tg+Semaglutide组新物体分辨率更高(P<0.05);与WT组相比,WT+Semaglutide组分辨率更高(P<0.05)。干预结束后(9月龄),各组间小鼠体质量及血糖浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白质印迹法实验中,与Tg组相比,Tg+Semaglutide组Tau231磷酸化水平降低(P<0.05);与WT组相比,WT+Semaglutide组Tau231磷酸化水平也略降低,但组间差异无统计学意义。酶联免疫吸附法实验中,与Tg组相比,Tg+Semaglutide组Aβ_(1-42)浓度降低(P<0.05);与WT组相比,WT+Semaglutide组Aβ_(1-42)浓度也降低(P<0.05)。结论索马鲁肽可降低AD小鼠血清中与认知相关的标志物Aβ_(1-42)水平和海马区Ser231位点磷酸化的Tau蛋白表达,能有效改善AD小鼠的认知功能,且索马鲁肽对小鼠体质量及血糖的影响在短时间里未见明显变化,安全性较高。

大蒜素对阿尔茨海默病转基因小鼠脑内Tau蛋白表达的影响

本文应用免疫荧光技术和Western blot方法检测大蒜素对tau转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白表达的影响,并测定野生型小鼠、tau转基因小鼠及大蒜素治疗组三组小鼠脑内SOD活力和MDA含量,结果发现大蒜素处理之后的阿尔茨海默病(AD)模型小鼠SOD与AD组相比活性增加,MDA含量减少,tau转基因小鼠脑内所检测的Ser202、Ser404、Ser396、Thr181位点tau蛋白发生过度磷酸化改变,大蒜素治疗组这些过度磷酸化的tau蛋白明显减少。以上结果提示大蒜素可以通过其强大的抗氧化作用降低AD小鼠脑内氧化应激效应,从而使AD小鼠脑内tau蛋白磷酸化水平下降,因此大蒜素在AD的临床治疗方面具有重要的理论意义。

Tau/APP/PS1三转基因小鼠模型的建立及生物学特征

目的：建立Tau／APP／PS1三转基因小鼠模型，从分子生物学、行为学及病理学角度研究其生物学特征。方法：将自行建立的Tau转基因小鼠与Jackson实验室引种的APP／PS1双转基因小鼠杂交、传代；PCR鉴定小鼠基因型；RT-PCR检测外源基因的转录；Western blot测定外源基因的蛋白表达；Bielachowsky氏染色法和ABC免疫组化法观察大脑神经纤维缠结和老年斑等病理改变；Morris水迷宫观测学习记忆的改变。结果：Tau／APP／PS1三转基因小鼠的大脑可转录和表达Tau、APP和PS1三种外源基因，6～8月龄时大脑皮层和海马可见神经元纤维缠结和老年斑，其学习记忆获得能力在6月龄开始受损。结论：建立的Tau／APP／PS1三转基因小鼠具有Tau和Aβ两种病理改变和学习记忆障碍，为深入探究Tau与邸的关系、阐明AD的发病机制以及研发靶点治疗药物提供实验工具。

雄性APP/PS1/Tau三转基因小鼠阿尔茨海默病样病理的年龄相关性变化

目的用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)方法观察2~15月龄雄性APP/PS1/Tau三转基因小鼠(Triple transgenic mice,3xTg),每两月龄,海马及感觉皮质中阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)相关病理的年龄相关性变化。方法雄性3xTg-AD三转基因小鼠按2、4、6、8、10、12、15月龄分为7组,每组各3只,作为实验组;雄性C5B7L/6J小鼠(Wild Type,WT)按2、4、6、8、10、12、15月龄分为7组,每组各3只,作为对照组。用免疫组化法方法检测各个小鼠脑组织海马及感觉皮质与阿尔茨海默病密切相关的病理年龄相关性变化:Aβ、磷酸化tau、人tau P301L突变体的转基因产物、星形胶质细胞增生、神经元标记物。结果与C5B7L/6J小鼠相比,APP/PS1/Tau三转基因小鼠Aβ细胞(6E10)、p-tau(AT8,Ser202/Thr205)、tau(HT7)星形胶质细胞(GFAP)免疫染色强度显著增强,P<0.0001;2~15月龄雄性APP/PS1/Tau三转基因小鼠海马及感觉皮质均未出现明显淀粉样斑块沉积,海马CA1区Aβ细胞(6E10)8月龄开始染色程度逐渐增强,感觉皮质区染色程度保持不变,P<0.05;CA1区tau(HT7)2~6月龄染色程度较弱,6~15月龄染色程度保持稳定,感觉皮质区2~4月龄染色程度升高,4~15月龄染色程度保持稳定,P<0.05;CA1区p-tau(AT8,Ser202/Thr205)6月龄磷酸化程度开始升高,感觉皮质区12月龄磷酸化程度开始升高,P<0.05;CA1区及感觉皮质区星形胶质细胞(GFAP)2~15月龄反应性逐渐增强;CA1区成熟神经元标记物(NEUN)数量2~6月龄逐渐减少,6~15月龄稳定,CA3区NEUN数量2~15月龄逐渐降低,P<0.05。结论3xTg-AD小鼠在年龄和表型的发展之间显示出明显的相互作用,这使其成为研究衰老在疾病发病机制中作用的重要工具。

二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因痴呆小鼠JNK和PP2B的调控作用研究

目的:研究二苯乙烯苷(TSG)对APP/PS1/Tau三转基因痴呆(3×Tg-AD)小鼠c-Jun氨基末端激酶(JNK)、钙调神经磷酸酶(PP2B)的调控作用,探索该药抗阿尔茨海默病(AD)的可能机制。方法:将45只雄性3×Tg-AD小鼠随机分为模型组、阳性对照组(石杉碱甲,0.15 mg/kg)和TSG低、中、高剂量组(0.033、0.1、0.3 g/kg),每组9只;另取9只正常雄性C57BL/6J小鼠作为正常对照组。各给药组小鼠灌胃相应药物,每天给药1次,连续给药60 d;正常对照组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水。给药结束后,通过Morris水迷宫实验测定各组小鼠的空间学习记忆能力,采用尼氏染色法观察小鼠大脑皮层和海马部位尼氏小体变化情况,并分别采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法和Western blotting法检测小鼠脑组织中JNK、PP2B的mRNA及蛋白表达情况。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01),原平台象限停留时间显著缩短(P<0.01),穿越平台次数显著减少(P<0.01);脑皮层和海马部位尼氏小体数量显著减少、着色浅;脑组织中JNK mRNA及其蛋白的相对表达量显著升高(P<0.01),PP2B mRNA及其蛋白的相对表达量显著降低(P<0.01)。与模型组比较,阳性对照组和TSG各剂量组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),原平台象限停留时间显著延长(P<0.01);穿越平台次数显著增加(P<0.01);脑皮质和海马部位尼氏小体数量显著增加、着色深;脑组织中JNK蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),PP2B mRNA及其蛋白的相对表达量显著升高(P<0.01),且TSG高剂量组小鼠脑组织中JNK mRNA的相对表达量显著降低(P<0.05)。结论:TSG对3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力及神经元损伤有一定改善作用,其机制可能与下调蛋白激酶JNK的转录和表达、上调蛋白磷酸酶PP2B的转录和表达有关。

无线神经遥测技术在阿尔茨海默病转基因小鼠恐惧学习记忆活动中的应用——海马Theta节律观察

APP/PS1/tau三转基因(3xTg)小鼠是国际公认的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)动物模型,其6月龄时即可表现出与海马相关的认知活动障碍及电生理指标异常,但同步记录AD小鼠行为学和脑电活动的研究仍鲜有报道。近年来,无线遥测技术的发展为同步记录小动物行为和脑电活动创造了条件。本研究利用无线神经遥测技术,结合行为学检测手段,同步记录了3xTg AD小鼠在恐惧记忆活动过程中的行为学表现和海马Theta节律变化,以期揭示AD时认知功能障碍与Theta节律的关系。结果显示:(1)恐惧学习训练阶段,3xTg小鼠与野生型(wild type, WT)小鼠相比,行为学和脑电活动均无明显差异;(2)记忆检测阶段,3xTg小鼠因条件刺激(conditioning stimulus, CS)引起的僵直比率显著低于WT小鼠;(3)条件刺激前(Pre-CS)与CS期间3xTg小鼠海马Theta节律的峰值功率均明显低于WT小鼠;(4) CS可有效提高WT小鼠海马CA1区Theta节律的峰值频率,而这一刺激对3xTg小鼠无效。以上结果表明,3xTg小鼠在认知行为障碍即恐惧学习记忆能力下降的同时,伴有海马CA1区Theta节律的发放频率与发放功率降低。据此推测,Theta节律活动的衰减与3xTg小鼠恐惧记忆行为障碍有关,增强海马Theta节律可能有助于认知行为的改善。

罗非昔布对阿尔茨海默病模型小鼠脑内tau蛋白表达的影响

目的研究罗非昔布对tau转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白表达的影响0方法实验小鼠分为对照组、AD模型组和罗非昔布治疗组，治疗组小鼠给予罗非昔布（2mg·kg^-1·d^-1）饮水喂养处理6个月，对照组和模型组均给予正常饮用水。应用水迷宫实验方法检测三组小鼠的学习记忆能力；并应用免疫荧光和Western blot等实验方法检测磷酸化tau蛋白在三组小鼠脑内的表达情况。结果Westemblot和免疫荧光结果显示AD模型小鼠脑内的tau蛋白磷酸化水平在Ser202和Ser404两个位点明显高于野生型小鼠，经罗非昔布干预6个月后，tau蛋白磷酸化水平较模型组降低；行为学实验结果提示罗非昔布治疗组小鼠在第3和第4天的平均潜伏期分别为（44．45±2．40）s和（36．7±3．09）s，搜索的平均路程分别为（1．55±0．17）m和（1．45±0．15）m，显著低于模型组小鼠的潜伏期和搜索的平均路程。结论罗非昔布能够降低AD小鼠脑内的tau蛋白磷酸化水平，进而改善其学习记忆能力，提示罗非昔布在AD的临床治疗方面具有重要的理论意义。

慢性睡眠剥夺加重APP/PS1/tau小鼠学习记忆能力和病理损伤

睡眠在认知功能和情绪的调节过程中发挥重要作用。近年研究显示,睡眠障碍是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)重要的危险因素之一,但慢性睡眠剥夺对于AD模型小鼠认知功能的影响及其机制尚不明确。本研究采用改良多平台法对8月龄雄性APP/PS1/tau三转基因AD模型(3xTg-AD)小鼠和野生型(wild type, WT)小鼠(每组8只)进行连续21天、每天20 h的睡眠剥夺。睡眠剥夺结束后,采用旷场、高架十字迷宫、糖水偏好、物体识别、Y迷宫和条件恐惧记忆实验等多种行为学手段观察慢性睡眠剥夺对3xTg-AD小鼠的焦虑和抑郁样行为以及多种认知功能的影响,并通过免疫组织化学染色观察小鼠海马区β淀粉样蛋白(amyloidβprotein, Aβ)斑块沉积、神经原纤维缠结和小胶质细胞的活化程度。结果显示:(1)慢性睡眠剥夺未影响3xTg-AD小鼠的焦虑(P=0.539)和抑郁样行为(P=0.874);(2)慢性睡眠剥夺加重了3xTg-AD小鼠的识别记忆(P<0.001)、工作记忆(P=0.002)和条件恐惧记忆能力(P=0.039)损伤;(3)慢性睡眠剥夺增加了3xTg-AD小鼠海马区Aβ斑块的沉积(P<0.001)和小胶质细胞的过度活化(P<0.001),但并未导致tau蛋白异常磷酸化和神经原纤维缠结出现。以上结果表明,慢性睡眠剥夺加重了3xTg-AD小鼠的识别记忆、工作记忆和条件恐惧记忆能力损伤,且其损伤作用与3xTg-AD小鼠海马区Aβ斑块沉积增加和小胶质细胞过度活化密切相关。

有氧运动对APP/PS1/tau小鼠海马gamma振荡的影响

目的:探讨有氧运动对APP/PS1/tau小鼠清醒状态海马CA1区theta时段gamma节律的影响以及对睡眠状态海马CA1区SWR时段低频gamma节律的影响。方法:清洁级6月龄APP/PS1/tau小鼠随机分为安静组(AS)、运动组(AE),C57BL/6J对照组小鼠随机分为安静组(CS)、运动组(CE)。AE组和CE组进行12周跑台运动,5 d/周,60 min/d,前10 min运动负荷为12 m/min,后50 min为15 m/min,跑台坡度为0°。八臂迷宫检测小鼠行为学变化;多通道在体记录技术记录海马CA1区清醒状态和睡眠状态的神经电信号,Matlab提取清醒状态theta时间段和睡眠状态的SWR时间段,多窗谱估计法进行时频分析和功率谱密度分析。结果:12周有氧运动可明显改善AS组的工作记忆和参考记忆,增加清醒状态海马CA1区theta时段的gamma能量和睡眠状态CA1区SWR时段的低频gamma能量。结论:有氧运动可改善AD模型神经网络状态,提高海马CA1区theta时段gamma能量和SWR时段低频gamma能量是其整体行为学改善的神经网络机制之一。

脂联素改善阿尔茨海默病模型小鼠焦虑抑郁样行为的分子机制

目的探讨脂联素(adiponectin,APN)对三转基因阿尔茨海默病(3xTg-AD)模型小鼠焦虑和抑郁样行为的影响及机制。方法9月龄3xTg-AD小鼠和野生型(WT)小鼠随机分为WT给生理盐水(WT+Saline)、WT给药(WT+APN)、3xTg-AD给生理盐水(3xTg-AD+Saline)和3xTg-AD给药(3xTg-AD+APN)四组,每组8只,在自由清醒状态下对两种小鼠经侧脑室慢性给予生理盐水(Saline)或APN。采用高架十字迷宫实验检测小鼠的焦虑情绪、糖水偏好及悬尾实验检测小鼠的抑郁情绪,Western blot检测海马组织p-AMPK、AMPK、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β和SIRT1表达水平。结果在高架十字迷宫实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠在开放臂停留时间百分比为[(4.2±2.7)%],明显低于WT+Saline组小鼠的[(10.1±4.1)%](q=4.349,P<0.01)和3xTg-AD+APN组小鼠的[(9.7±3.3)%](q=4.065,P<0.01)。在糖水偏好实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的糖水偏好率为[(48.8±5.3)%],明显低于WT+Saline组的[(60.9±6.7)%](q=4.522,P<0.01)和3xTg-AD+APN组的[(59.3±6.2)%](q=3.911,P<0.05)。在悬尾实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的不动时间百分比为[(40.7±9.9)%],明显高于WT+Saline组的[(27.1±4.8)%](q=5.257,P<0.001)和3xTg-AD+APN组的[(31.4±6.0)%](q=3.624,P<0.05)。Western blot检测结果显示,四组小鼠海马组织的AMPK和GSK-3β的相对蛋白表达水平没有差异。但与WT+Saline组相比,3xTg-AD+Saline组小鼠海马组织中的p-AMPK(q=3.586,P<0.05)、p-GSK-3β(Ser9)(q=3.125,P<0.05)和SIRT1(q=3.044,P<0.05)的表达水平均明显降低。与3xTg-AD+Saline组小鼠相比,3xTg-AD+APN组小鼠的p-AMPK(q=3.374,P<0.05)和p-GSK-3β(Ser9)(q=3.063,P<0.05)表达水平上调,但SIRT1表达水平差异无统计学意义。结论脂联素可以通过上调海马组织的p-AMPK和p-GSK-3β(Ser9)表达水平有效缓解9月龄3xTg-AD小鼠的焦虑和抑郁样行为。