CRISPR靶向切割毒力因子tcdB基因抑制致病艰难梭菌生长

目的应用CRISPR/Cas9系统对艰难梭菌主要毒力因子tcdB基因进行切割,达到特异性抑制致病艰难梭菌生长的效果。方法在线设计针对tcdB的sgRNA,分别将sgRNA与Cas9单独或共同作用于tcdB基因扩增产物,验证体外切割效能;分别将穿膜肽(CPP)-sgRNA或单独的sgRNA与CPP-Cas9单独或共同作用于产毒艰难梭菌,通过监测菌液A值和菌落计数,观察对细菌生长的抑制效果。同样的方法处理肠道其他细菌,验证特异性。结果sgRNA和Cas9共同作用可把tcdB扩增产物有效切割,而单独加入sgRNA或Cas9均无切割作用;单独加入CPP-sgRNA、CPP-Cas9、CPP对细菌生长没有影响;CPP-sgRNA与CPP-Cas9共同作用,无细菌生长;单独sgRNA与CPP-Cas9共同作用,细菌生长轻度受抑。用同样的方法将CPP-sgRNA+CPP-Cas9处理肠道其他细菌后,菌液A值和菌落计数与空白对照无差别。结论建立的针对tcdB的sgRNA与Cas9混合可在体外高效切割tcdB基因,抑制细菌生长;CPP可提高sgRNA转染进入细菌的效率。