霍乱弧菌毒素协同调节菌毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的 以新疆分离 0 13 9霍乱弧菌XJ93 0 0 6株的DNA为模板 ,自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因 (包括侧序列 )并构建重组载体。方法 以 0 13 9霍乱弧菌新疆分离株XJ93 0 0 6基因组DNA作为模板 ;根据O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpAPCR引物 ,高保真酶扩增tcpA片段 :限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒 ,T4DNA连接酶连接酶切产物 ,重组质粒转化大肠杆菌TB1工程菌 ,蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆 ;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析 ,比较。结果 DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB193_tcpA的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间切出一个10 3 7bp的DNA片段 ,测序结果与O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961、O13 9霍乱弧菌标准株M0 45的tcpA同源性均达到 99 9%以上。结论 成功构建O13 9霍乱弧菌新疆分离株XJ93 0 0 6毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEB193_tcpA ;序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因在O1群EITor型霍乱弧菌和O13 9霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因 ,可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因。另外为研究O13

霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

目的研究中国霍乱弧菌(VC)毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型(EVC)产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型(t2型).50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.

霍乱弧菌O139和El Tor菌株tcpA分子特征的研究

[目的]从霍乱弧菌XJ93006、MO45、XJ89079中克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因(包括侧序列)并测序比较。[方法]PCR扩增tcpA片段;克隆该片段;提取质粒经鉴定后测序并利用DNAMAN对该序列进行序列分析,比较。[结果]成功构建XJ93006、MO45、XJ89079 tcpA基因的重组质粒。三株霍乱弧菌及与N16961 tcpA基因及其两侧核酸序列同源性XJ89079和N16961为100%,XJ93006和XJ89079为99.8%,XJ93006和MO45为99.5%,XJ89079和MO45为99.7%。[结论]该研究初步认为我国新疆VC O139与本地EVC关系密切。

tcpA基因单核苷酸多态性对O139群霍乱弧菌产毒株环境适应性的影响

目的研究tcpA基因的核苷酸突变对O139群霍乱弧菌产毒株环境适应性的影响。方法使用生物信息学方法确定tcpA基因在O139产毒株中的变异,使用同源重组方法构建tcpA基因突变株,通过比较原型株和突变株的生物膜形成、菌毛形成以及在不同浓度的营养物质条件下的生长情况,研究两者的生长和差异。结果在不同pH值条件下,无论是单独生长还是在模拟人体胃肠道环境的竞争实验中,突变株1都表现出更强的生长能力。结论tcpA基因的核苷酸突变影响O139群霍乱弧菌产毒株酸碱耐受能力。

霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析

目的分析广东霍乱弧菌（VC）代表菌株主要毒力基因和管家基因序列。方法PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因（ctxAB和tcpA）和管家基因（dnaE、hlyA、mdh和recA）、基因测序、对序列进行生物信息学分析。结果不同年代分离的2株埃尔托型（EVC）产毒株和1株0139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较，ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99．7％～100％和98．8％～100％．ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98．8％～100％和96．8％～100％，tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100％同源。3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99．8％～100％，100％，99．5％～99．8％和100％，氨基酸序列同源性分别为100％．100％，98．5％～99．3％和100％；3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97．0％～97．2％，91．8％，94．1％～94．4％，96．9％，氨基酸序列同源性分别为100％，94．6％，94．3％～98．5％和99．7％。结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切，而与O139群VC非产毒株较远，O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。

霍乱弧菌JS94484株CTX^(EVC)_φ和nct-CTX^(new)_φ基因组变异区序列分析

目的对霍乱弧菌JS94484株CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组变异区进行序列分析。方法采用聚合酶链反应、基因测序及序列分析。结果JS94484株CTXEVCφ基因组的ig1、rstR、ig2和ctxAB基因与EVC标准株N16961的高度同源。JS94484株nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因,与目前发现的3种类型的同源性均较低,趋异性均较高。CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组zot基因末端约60bp的基因序列差别较大,推测的氨基酸序列差别也较大。JS94484株的tcpA基因序列与EVC标准株N16961的完全一致。结论霍乱弧菌nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因为新类型,基因功能有待于进一步研究。

多重聚合酶链式反应(MPCR)用于霍乱弧菌检测的研究

本文首先从实用的角度探讨用三对特异的引物对不同血清群霍乱弧菌进行ＭＰＣＲ检测的可能性。这三对引物具有很大的应用价值，从一次扩增反应中可以得出有关菌株的毒力因子和血清群的信息。检测的敏感性可达到１０ＣＦＵ。实验还提示将引物数量改为五条寡核苷酸链来进行ＭＰＣＲ能得出同样的结果。对Ｐ３、Ｐ４引物扩增形成的６１７ｂｐ的ＤＮＡ片段进行酶切分析表明，埃尔托型霍乱弧菌Ｏ１３９群霍乱弧菌的ｔｃｐＡ基因有很大的相似性，至少在ＰｓｔⅠ和ＢｇｌⅡ酶切位点上表现相同，但两者均与古典型霍乱弧菌不同。