Sanger测序和AMRS-PCR检测ALDH2基因突变结果的比较

目的比较Sanger测序法与扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)在检测患者线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因突变方面的差异。方法将2019年10月至2020年1月于陆军军医大学第一附属医院治疗的350例有冠心病、心肌梗死、心绞痛、原发性高血压病史的患者纳入研究,收集受试者外周血标本。用Sanger测序法与ARMS-PCR法检测ALDH2基因突变,分析两种方法检测结果的差异。结果两种方法检测ALDH2基因突变的总突变率均为33.1%,AA纯合型突变率为3.7%,GA杂合型突变率为29.4%。两种方法检测结果的总符合率为100.00%,突变型阳性符合率和阴性符合率均为100.00%,ARMS-PCR法与Sanger测序法对临床标本的检测结果一致性较好(Kappa≥0.7,P<0.05),具有等效性。另外,ARMS-PCR法检测出的ALDH2基因型分布情况与性别、年龄无关(P>0.05)。结论Sanger测序法和ARMS-PCR法均可准确、有效地检测ALDH2突变情况,但基于成本优势和操作简便的原则,ARMS-PCR法在临床实践中更具优势。

采用微滴式数字PCR技术检测血浆EGFR基因突变状态在晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效评估中的价值

目的探讨采用微滴式数字PCR技术检测晚期非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变状态的可行性,及检测结果与接受埃克替尼疗效的相关性。方法分别采用AMRS法检测肿瘤组织样本,dPCR检测配对的血浆样本筛查晚期非小细胞肺癌患者(ⅢB/Ⅳ期)258例的EGFR表达状态,以肿瘤组织中的EGFR突变状态检测为对照,计算ddPCR法检测血浆EGFR突变状态的灵敏度、特异度、一致率。对于组织检测阳性和(或)血浆检测阳性的晚期NSCLC患者均给予埃克替尼靶向治疗。结果以配对的肿瘤组织EGFR突变检测结果为对照,ddPCR法检测血浆EGFR突变的灵敏度、特异度及一致率分别为66.7%,98.5%,83.8%。123例患者组织检测阳性和(或)血浆检测阳性,接受埃克替尼治疗,其中组织AMRS法检测阳性且血浆ddPCR检测阳性为A组(80例);组织AMRS检测阳性而血浆ddPCR检测阴性为B组(41例);组织AMRS检测阴性而血浆ddPCR检测阳性为C组(2例)。3组患者的DCR、ORR、PFS比较差异均无统计学意义(P=0.118,0.158,0.076)。结论 ddPCR法检测晚期NSCLC血浆中EGFR基因突变方法灵敏,取材方便;应用检测结果指导临床EGFR-TKIs治疗疗效与组织学检测结果比较差异无统计学意义,提示该方法预测疗效有良好的临床应用前景。

建立RT-ARMS-qPCR系统定量测定含A1555G突变的线粒体DNA拷贝数

目的建立RT-ARMS-qPCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR)系统定量测定含线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)A1555G位点突变的片段的拷贝数,为阐明线粒体耳聋临床表型多样性的分子生物学基础奠定基础。方法根据ARMS的基本原理设计引物,在引物3’端插入错配碱基AC建立RT-ARMS-qPCR系统,优化定量PCR体系,并进行方法学评价。经PCR分别扩增相应突变型和野生型的片段,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;同时对含突变型和/或野生型mtDNA 1555位点的片段的拷贝数进行定量检测。结果RT-ARMS-qPCR系统用于检测含mtDNA 1555位点的片段,线性检测范围为102-108拷贝数/μl,检测灵敏度为1×102拷贝数/μl,其批内变异系数(CV)为1.34%,批间CV为1.96%,重复性好;突变型和野生型引物分别只扩增相应片段,特异性好。结论RT-ARMS-qPCR系统适合于定量检测含mtDNA A1555G点突变的线粒体DNA片段,结果稳定、准确,有助于阐明线粒体耳聋严重程度的分子基础。

基于突变阻滞扩增系统的实时荧光PCR技术检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变及其评价

目的探索突变阻滞扩增系统(ARMS)联合实时荧光PCR技术用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变的可行性。方法以幽门螺杆菌23S rRNA基因2143位点的两种基因型(野生型为AAA,突变型为AGA)质粒DNA为研究模型,设计ARMS引物同时对实时荧光PCR体系进行优化,对突变阻滞扩增系统联合实时荧光PCR技术的基因分型特异性进行评价。结果在与模板匹配的ARMS引物3'端附近故意引入错配碱基,降低该ARMS引物浓度和镁离子浓度,并采用两步PCR循环的反应程序,使ARMS引物的特异性增强,能够得到清晰的基因分型结果。结论这种基于突变阻滞扩增系统的实时荧光PCR技术,实验设计简便,特异性较好,并有望在此基础上发展成为适合临床应用的突变检测方法。

微滴式数字PCR技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变

目的分析微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外周血EGFR基因突变检测中的应用价值。方法采用dd PCR法与扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)分别检测58例NSCLC患者及TKI治疗后耐药患者20例外周血EGFR基因突变,Kappa检验验证dd PCR法检测EGFR基因突变结果与ARMS法的一致性,并对检测结果进行分析比较。结果 ARMS法检测EGFR基因突变共检出34例患者,其中双突变患者5例,dd PCR法共检出38例患者,其中双突变患者10例;两者Kappa值=0.72,阳性一致率为97.50%,阴性一致率为72.73%,总一致率为86.30%;dd PCR法检测接受TKI治疗患者的20外显子p.T790M位点突变检出率为50.00%(10/20),而无TKI用药史患者均未检出;dd PCR法检出突变丰度<1%的突变位点占总突变位点的29.17%(14/48),ARMS法仅检出其中的35.71%(5/14)。结论 dd PCR法与ARMS法相比具有更高敏感性,且可绝对定量,EGFR基因突变的检出率更高。

小麦抗麦红吸浆虫候选基因TraesCS4A01G437800的四引物ARMS-PCR标记开发

麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana Géhin)是影响我国小麦生产的重要害虫,选育抗虫小麦品种是控制虫害最为有效的措施,而利用通量高、成本低的抗虫相关标记对提高小麦抗虫种质资源筛选和分子育种效率具有重要意义。本研究根据前期挖掘到的抗虫候选基因TraesCS4A01G437800序列中存在的SNP位点开发了1个四引物ARMS-PCR标记T3-1-1,并在92个RIL株系和95个小麦品种中进行了标记有效性检测。结果表明:T3-1-1在RIL株系间的检测有效率在90%左右,在供试高抗、高感小麦品种中的检测有效率较高,分别为63.16%和96.43%,可用于小麦种质资源的抗虫性筛选和抗虫性分子标记辅助选择。进一步分析发现,在具有抗虫位点的14个抗虫小麦品种中,多为生产上很少使用的老品种,因此鉴定和创新小麦抗虫种质资源尤为重要。

Super-ARMS PCR和ddPCR检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA EGFR基因T790M突变的临床价值研究

目的探讨超级扩增阻滞突变系统PCR(Super-ARMS PCR)和微滴式数字PCR(ddPCR)检测晚期肺腺癌患者经表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKI)治疗后血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变情况和应用价值。方法经EGFR-TKI治疗后耐药的124例患者分别应用Super-ARMS PCR法和ddPCR法检测T790M突变情况,比较2种方法检出率,用药时间及突变丰度的相关性。结果2种方法共检出51例T790M突变,诊断结果一致性较好,Kappa=0.756;2种方法阳性符合率为74.00%,阴性符合率98.65%,总符合率88.71%。用药超过12个月的患者采用Super-ARMS PCR法检测T790M突变的检出率高于用药小于12个月的患者(P<0.05)。ddPCR法检测突变丰度为0.01%~68.10%。结论2种方法在晚期肺腺癌患者经EGFR-TKI治疗后T790M突变检测中具有较高的一致性,ddPCR法灵敏度更高且可以提供突变丰度的信息。

基于PCR 的稀有突变检测方法

稀有突变检测是基因检测的一个重要组成部分,也是临床应用上面临的一个巨大挑战。目前,稀有突变的检测方法很多,本文从已知突变的中等灵敏度检测方法、已知突变的高灵敏度检测方法和未知突变的富集检测方法3个部分综述了本领域中近年来的研究进展,同时对常见的可能具有较好应用前景的检测方法进行了详细介绍。

水稻垩白基因Chalk5功能标记的开发与应用

水稻垩白是衡量水稻外观品质优劣的重要指标之一,降低稻米的垩白是培育优质水稻品种的前提。Chalk5是一个能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因。为提高垩白基因Chalk5在育种中的选择效率,在前人克隆的基础上,根据其启动子区域存在的2个功能突变位点,分别设计等位基因特异PCR(ARMS-PCR)引物,最终筛选出2对Chalk5基因的功能标记Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22,通过PCR产物测序的方法对这2对标记的检查结果进行了验证,说明Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22可以准确鉴定出Chalk5的不同基因型。利用该标记对不同来源的43份籼稻资源、江苏2007-2013年审定的65份粳稻品种和太湖流域179份粳稻地方资源进行了Chalk5基因型检测,筛选到携带chalk5低垩白率等位基因的籼稻资源20份,太湖流域粳稻地方资源仅8份,其余259份粳型资源中均不携带chalk5低垩白率等位基因,这也说明chalk5主要分布在籼型水稻资源中,在粳型资源中分布很少。

载脂蛋白E基因多态性与原发性高尿酸血症相关性研究

目的:探讨维吾尔族与汉族载脂蛋白E基因多态性与原发性高尿酸血症的相关性。方法:收集2006年1～12月在新疆医科大学附属中医医院和乌鲁木齐市宝科达医院健康体检的670人血标本,检测血尿酸、血液生化指标以及ApoE基因型。结果:新疆维吾尔族和汉族ApoE基因型分布差异有统计学意义(P<0.05),汉族高尿酸组和正常组ApoE基因型分布总体差异有统计学意义(P<0.05),而维吾尔族总体差异无统计学意义(P>0.05)。汉族和维吾尔族ApoE基因型中E3/3占主导,汉族E2/2>E4/4,而维吾尔族正好相反。与正常组相比,高尿酸组ApoEε2等位基因频率降低,而ε4频率升高,ε4等位基因可能是原发性高尿酸血症的危险因素。两个民族高尿酸组不同等位基因血尿酸(SUA)和除高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)外的各生化指标均高于正常组,而且两个民族高尿酸组和正常组尿酸和血脂代谢指标水平在ApoE等位基因ε2、ε3、ε4型中也有一定的差别。结论:ApoEε4等位基因可能是汉族和维吾尔族原发性高尿酸血症的遗传易感基因,但仍然表现出民族的差异。

非综合征型耳聋患者mtDNA A1555G异质性突变比例与临床表型的关系

目的定量检测非综合征型耳聋患者线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)1555突变型/野生型的拷贝数,探讨突变型/野生型比例与临床表型之间的关系。方法建立实时定量PCR技术和扩增阻滞突变系统(Real-time quantitative PCR和Amplification refractory mutation system,RT-ARMS-qPCR系统)对含突变型和野生型mtDNA 1555位点的拷贝数进行定量检测并计算比例。共检测散发组12例、家系组7例异质性突变患者,结合耳聋患者的临床资料,分析突变型与野生型的比例与耳聋严重程度的关系。结果散发组mtDNA A1555G异质性突变的患者中,突变型mtDNA所占的比例与耳聋轻重程度相关(r=0.771,P=0.003);家系组患者中,突变型mtD-NA所占的比例亦与耳聋轻重程度相关(r=0.850,P=0.015)。结论突变型mtDNA占所有mtDNA的比例与耳聋的严重程度密切相关,是非综合征型耳聋临床表型多样性的分子基础。

应用四引物扩增阻滞突变体系PCR技术检测柔嫩艾美耳球虫二氢蝶酸合酶N377D突变

面对严重鸡球虫病的磺胺耐药性,传统检测磺胺耐药的方法已无法满足临床应用,因此建立一种新的磺胺耐药柔嫩艾美耳球虫检测方法具有重要意义。本研究建立了一种使用四引物扩增阻滞突变体系PCR技术(amplification refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR)用于准确区分柔嫩艾美耳球虫二氢蝶酸合酶(dihydropteroate synthase,DHPS)基因中的点突变(A1129G)。对ARMS-PCR反应进行优化,最佳内外引物工作浓度比是5∶1,Mg^(2+)的最优工作浓度为10 mmol/L,dNTP的最优工作浓度为0.15 mmol/L,最佳Taq酶体积为0.1μL,最佳退火温度为62℃。本研究发现在合适的PCR体系下,能够检测出含有磺胺耐药柔嫩艾美耳球虫的最低检测限为40 fg,表明该方法灵敏度良好;通过在1对内引物(F-inner377s/R-inner377r)上倒数第3位碱基上分别引进错配,使该方法的特异性提高。因此,ARMS-PCR方法是一种简单快速的用以区分临床分离株单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的基因分型方法。

雌核发育一代翘嘴鲌抑制素βB基因SNP筛选及其与生长性状的关联性分析

【目的】抑制素属于转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族成员,该超家族的多个基因均已证明直接或间接与肌肉生长发育相关。研究探讨了翘嘴鲌(Culter alburnus)抑制素βB基因(inhibinβB,INHBB)的多态性及其与雌核发育一代翘嘴鲌群体生长性状的关联性,为揭示抑制素βB基因对翘嘴鲌生长发育的影响奠定基础。【方法】实验通过翘嘴鲌转录组数据库设计引物,扩增抑制素βB基因的外显子序列,利用直接测序法获得2个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)。然后通过四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR,tetra-primer ARMS PCR)技术,对144个雌核发育一代翘嘴鲌样本的SNP位点进行分型,并将SNP位点基因型与翘嘴鲌7个形态性状(体长、体质量、体厚、体高、全长、尾柄长、尾柄高)进行关联性分析。【结果】优化PCR反应条件后,在退火温度为61.5℃,内、外引物各浓度比例为2∶1时,c.717G>T位点得到良好的分型结果;在退火温度为58.8℃,内、外引物各浓度比例为1∶1时,c.778G>A位点得到良好的分型结果。抑制素βB基因c.717G>T位点和c.778G>A位点不同基因型与7个生长性状之间都存在显著差异(P<0.05)。其中,c.717G>T位点GG基因型和c.778G>A位点GG基因型是与翘嘴鲌生长性状有关的有利突变。一般线性模型分析了这2个SNP位点的3种高频率双倍型(分别为双倍型D1、D2和D3),结果表明双倍型D1和D2的7个生长性状指标均显著高于双倍型D3(P<0.05)。【结论】抑制素βB基因c.717G>T位点和c.778G>A位点均具有作为雌核发育一代翘嘴鲌分子标记辅助选育的潜力,而且c.778G>A位点GG基因型对雌核发育一代翘嘴鲌生长性状的影响更加显著,研究可以为翘嘴鲌分子育种提供新的分子标记。

基于四引物扩增受阻突变体系PCR的多重乳腺癌相关SNP位点检测方法的建立

为提高单核苷酸多态性检测的通量,引入多重嵌合引物PCR和毛细管电泳对四引物扩增受阻突变体系PCR进行改进.针对乳腺癌位点rs4784227(C>T),rs1219648(G>A)和rs3803662(T>C)设计特异性嵌合引物,经一次PCR扩增后,通过毛细管电泳分析产物长度,同时确定3个位点的基因型.70份全血和口腔拭子样本,电泳结果均与测序一致,实现成功分型.本方法仅需一次PCR和一次毛细管电泳即可获得3个位点的分型结果,操作简单、快速准确.

数字PCR法和探针扩增阻滞突变法检测非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体突变的比较研究

目的比较数字PCR法和ARMS法检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变的差异,验证数字PCR法的检测性能。方法以ARMS法作为对照参考方法,对36例EGFR突变阳性的NSCLC标本,采用数字PCR法进行EGFR基因突变检测,对结果进行比较研究。结果 ARMS法显示的22例21外显子突变阳性标本中,数字PCR检测全为阳性;ARMS法显示的14例19外显子突变阳性标本中,数字PCR共检出13例19外显子突变阳性。且数字PCR法可以定量检测EGFR突变比率,与临床分期具有相关性。结论数字PCR法与ARMS法的检测一致性较高,可以直接实现绝对定量,对指导患者的个体化治疗具有重要价值。

四引物扩增受阻突变体系PCR法检测慢性丙型病毒性肝炎患者白细胞介素-28B基因rs8099917位点单核苷酸多态性

目的建立四引物扩增受阻突变体系-PCR(amplification refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR)技术,检测河南地区慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C,CHC)患者白细胞介素(interleukin,IL)-28B基因rs8099917位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分布情况。方法应用生物信息学软件设计IL-28B基因SNP rs8099917位点全长序列特异性四引物序列,建立ARMS-PCR技术;采集河南地区138例CHC患者外周血并提取DNA,行ARMS-PCR,PCR反应产物行体积分数1%琼脂糖凝胶电泳判定rs8099917位点基因型,并随机对20例患者标本中阳性条带的扩增产物进行直接测序确定基因型,评价ARMS-PCR的准确性。结果 ARMS-PCR成功建立;IL-28B基因rs8099917位点SNP基因型为T/T型(252bp和182bp)、G/G型(252bp和131bp)和T/G型(252bp、182bp和131bp),电泳显示条带清晰,大小符合预期分子量,无非特异性条带扩增;138例CHC患者IL28B基因rs8099917位点SNP中T/T型105例(76.1%),G/G型4例(2.9%),T/G型29例(21.0%);以基因测序结果为标准,ARMS-PCR技术检测准确率为100%。结论河南地区慢性丙型病毒性肝炎患者IL-28B基因rs8099917位点SNP基因型以T/T型为主,ARMS-PCR检测准确、简便经济、高效,适用于临床检测。

含1555位点的线粒体DNA拷贝数与非综合征型耳聋临床表型的关系

目的定量检测非综合征型耳聋患者mtDNhA1555G突变型／野生型的拷贝数，探讨mtDNAA1555G突变型的拷贝数与临床表型之间的关系。方法建立RT—ARMS—qPCR系统对含突变型和野生型mtDNA1555位点的拷贝数进行定量检测并计算其突变的比例。结合散发组和家系组耳聋患者的临床资料，分析mtDNAA1555G突变型的拷贝数与耳聋严重程度的关系。结果散发组mtDNAA1555G同质性突变的患者中，突变拷贝数与耳聋轻重程度无关（R=0．001，P=0．997）；散发组mtDNAA1555G异质性突变的患者中，突变型与野生型的拷贝数比例与耳聋轻重程度相关（R=0．771，P=0．003）；家系组mtDNAA1555G同质性突变的拷贝数与耳聋轻重程度相关（R=0．341，P=0．022）；家系组mtDNAA1555G异质性突变的拷贝数与耳聋轻重程度相关（R=0．85，P=0．015）。结论含mtDNAA1555G点突变的拷贝数与非综合征性耳聋的严重程度密切相关，为揭示非综合征耳聋临床表型多样性奠定了基础。

抗原肽运载体TAP2基因与乙型肝炎病毒感染预后的相关性研究

目的 研究上海地区中国人群抗原肽运载体(transporter associated with antigen processing, TAP)基因与HBV感染以及慢性HBV感染和慢性肝炎并发肝硬化之间的相关性。方法 收集临床病例,检测乙型肝炎病毒标志,参照“病毒性肝炎防治方案2000”,选取101例乙型肝炎病毒感染者,21例HBV感染康复者及113例正常对照,进行TAP2 等位基因分型。对数据分组进行统计分析。结果 慢性乙型肝炎组的TAP2 *0201基因频率显著低于感染恢复组(χ2 =4.95, P<0.03);肝硬化组的TAP2 *0101基因频率显著高于正常对照组(χ2 =5.72, P<0.02);在慢性乙型肝炎并发肝硬化组中DR4与TAP2 *0101等位基因间存在显著的连锁不平衡(△=0.026,P<0.05)。结论 TAP2 *0101等位基因型携带者易感慢性乙型肝炎和乙型肝炎并发肝硬化,而TAP2 *0201则表现出对慢性乙型肝炎的抗性。两者均与HBV感染的预后似有一定相关。

毛球标本在人类基因型研究中的应用

目的 探讨毛球微量标本在人类基因型研究中的价值。方法 对 463名健康人采用多重放大受阻突变系统聚合酶链反应技术 (multi ARMSPCR )进行载脂蛋白E(apoE)基因分型 ,对 2 0名健康人采用三色荧光标记引物复合扩增短串联重复序列 (STR)技术 ,进行人类基因组的 9个STR位点分析 ,并对两种标本的检测结果进行分析对比。结果 同一个体毛球标本和全血标本apoE基因型检测结果完全一致 ,9个STR位点多态性结果也完全一致。运用multi ARMSPCR技术检测apoE基因型 ,频率分别为ε3 / 3 68 9% ,ε3 / 2 15 8% ,ε4/ 3 12 1% ,ε4/ 2 1 7% ,ε4/ 40 9% ,ε2 / 20 6%。ε2、ε3、ε4等位基因频率分别为 9 4%、82 8%和 7 8%。结论 人头发的毛球标本易采集、易保存 。

犬瘟热毒株CDV/R-20/12部分生物学特性鉴定

为了验证从健康貉子肺脏中分离的1株貉源犬瘟热毒株CDV/R-20/12的生物学特性,研究应用ARMS-PCR、致病性试验、同居感染试验、毒力返强试验及免疫后中和抗体效价测定对其进行鉴定。结果表明:该毒株为犬瘟热弱毒株,具有稳定的免疫原性。