Gly33的缺失和突变对hTrx-1抗氧化活性的影响

为探讨人硫氧还蛋白hTrx-1活性位点保守序列中Gly33残基在还原氧化性蛋白过程中是否必不可少,通过合成突变基因对hTrx-1的Gly33残基进行缺失和替换(G→A)。合成的突变基因随后在原核细胞中表达并进一步纯化及检测抗氧化活性,结果表明,无论是Gly33残基的缺失还是突变为Ala,突变的hTrx-1均能在原核细胞中高效表达,暗示2种突变型hTrx-1均能形成“Trx折叠”结构。抗氧化活性检测表明Gly33残基缺失的情况下,其抗氧化能力有所下降,当Gly33突变为Ala时,其抗氧化能力大幅下降到接近失去抗氧化能力。推测Trx-1活性中心保守氨基酸残基的改变影响了活性中心区域的几何构象,从而导致底物蛋白难以从空间上靠近。参与形成二硫键巯基的含量检测结果表明,突变型hTrx-1中形成二硫键巯基的含量明显低于野生型hTrx-1中形成二硫键巯基的含量,推测突变型hTrx-1的Cys32与Cys35形成二硫键的能力受到影响。

姜黄素调控Trx-1/TXNIP复合体防治对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤的研究

为了探讨姜黄素(CUR)对对乙酰氨基酚(APAP)诱导小鼠肝脏损伤的保护作用及机制,试验将60只ICR小鼠随机分成正常对照组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组(按体重150 mg/kg灌胃N-乙酰半胱氨酸)、姜黄素低剂量组(按体重50 mg/kg灌胃CUR)、姜黄素中剂量组(按体重100 mg/kg灌胃CUR)和姜黄素高剂量组(按体重200 mg/kg灌胃CUR),对模型组、N-乙酰半胱氨酸组及姜黄素低、中、高剂量组连续灌胃10 d,然后一次性按体重300 mg/kg腹腔注射APAP诱导小鼠急性肝损伤,24 h后,摘眼球取血并处死各组小鼠,计算小鼠肝脏指数,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,以及肝脏组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量,活性氧(ROS)水平;并取肝脏组织进行H.E.染色,观察小鼠肝脏病理组织学变化。通过RT-qPCR方法检测肝脏中Trx-1/TXNIP/NLRP3通路mRNA相对表达量。结果表明:与正常对照组比较,模型组小鼠的肝脏指数,血清ALT、AST、LDH活性,肝脏组织MDA含量、ROS水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),肝脏组织GSH含量和CAT、SOD活性显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),Trx-1 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA相对表达量极显著增加(P<0.01)。与模型组相比,姜黄素低中高剂量组小鼠血清ALT、AST、LDH活性,肝脏指数和肝脏组织MDA、ROS含量极显著降低(P<0.01),肝脏组织CAT、SOD活性和GSH含量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),Trx-1的mRNA相对表达量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。模型组肝脏组织肝索紊乱,肝细胞大量坏死,核溶解,肝窦炎性浸润和充血;姜黄素各剂量组肝索结构基本正常,肝细胞坏死减少。说明姜黄素通过抗氧化和抗炎作用对APAP诱导的小鼠急性肝损伤发挥保护作用,其机制可能与Trx-1表达量增加和TXNIP表达量降低有关。

川芎嗪通过调控Txnip/TRX/NF-κB通路对急性肺损伤小鼠的保护作用研究

目的探索川芎嗪对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠的保护作用,并探寻其可能的作用机制。方法选取50只健康BABL/c小鼠,随机分为对照组、模型组、地塞米松组(2 mg/kg)、川芎嗪低剂量组(20 mg/kg)和川芎嗪高剂量组(40 mg/kg)。对照组和模型组给予生理盐水,地塞米松组(2 mg/kg)、川芎嗪组(20、40 mg/kg)灌胃给予相应药物。给药1 h后,除对照组外,其余各组小鼠气管滴注20μg LPS。测定小鼠肺湿/干质量比,观察肺组织病理学变化,相应试剂盒检测肺组织超氧化物歧化酶(SOD)水平和丙二醛(MDA)含量,ELISA法检测白细胞介素-1β(1L-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达,Western blotting检测Txnip、TRX和p-NF-κB p65蛋白表达。结果川芎嗪可显著缓解LPS诱导的ALI小鼠的肺水肿程度(P<0.01);显著上调SOD活力,下调MDA含量(P<0.05);有效降低小鼠肺组织炎性细胞因子表达水平(P<0.05);降低Txnip、pNF-κB p65的表达,上调TRX的表达(P<0.05)。结论川芎嗪可能通过Txnip/TRX/NF-κB信号通路缓解LPS诱导的ALI。

姜黄素通过抑制TXNIP/TRX-1/GPX4通路介导的铁死亡减轻脓毒症小鼠肺损伤

目的探究姜黄素(Cur)是否通过调控TXNIP/TRX-1/GPX4通路抑制铁死亡减轻脓毒症肺损伤。方法雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组、脓毒症(盲肠结扎穿孔术,CLP)组、CLP+各浓度Cur(50、100和200 mg/kg)组、CLP+Cur(200 mg/kg)+TRX-1抑制剂PX-12(25 mg/kg)组,10只/组,检测各组小鼠肺组织炎症因子及铁死亡关键因子MDA、MPO、GSH水平。Beas-2B细胞分为Con组、脂多糖组(LPS,1μg/mL)、LPS+各浓度Cur(2.5、5、10μmol/L)及LPS+Cur(10μmol/L)+PX-12(5μmol/L)组,检测MDA和Fe^(2+)水平,DHE染色评估ROS变化。Western blotting检测肺组织和Beas-2B细胞TXNIP、TRX-1、GPX4和X-CT蛋白表达水平。结果与Sham组相比,CLP组小鼠肺损伤严重,IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA、MPO含量增加,GSH含量下降(P<0.01);与CON组相比,LPS组MDA、Fe^(2+)、ROS水平升高;CLP组肺组织和LPS组Beas-2B细胞TXNIP蛋白表达增加,TRX-1、GPX4及X-CT蛋白表达减低(P<0.01);与CLP组相比,CLP+Cur各浓度组肺损伤减轻,炎症因子和脂质过氧化因子含量降低,GSH水平升高;与LPS组相比,LPS+Cur各浓度组Fe^(2+)、MDA和ROS水平下降(P<0.05);TXNIP蛋白表达降低,TRX-1、GPX4及X-CT蛋白表达增加(P<0.01)。PX-12干预后,取消了Cur对脓毒症肺组织和Beas-2B细胞的保护作用(P<0.05)。结论姜黄素通过升高TRX-1、GPX4,降低TXNIP抑制铁死亡,减轻脓毒症肺损伤。

拟南芥TRX-h5基因的克隆和表达分析

硫氧还蛋白(TRX-h)是一类催化二硫键还原的小分子蛋白,在调控氧化应激响应中发挥重要作用。为了研究硫氧还蛋白的结构及其功能,文章以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia(Col-0)为研究材料,通过反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术获得TRX-h5基因的编码序列(coding sequence,CDS),体外构建pET28a(+)-TRX-h5及pET28a(+)-TRX-h5M(第39位和第42位半胱氨酸位点突变)的原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,诱导后经镍柱纯化得到带有6个His标签的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳技术检测到14 kDa处的目的条带,与理论值预测一致。运用生物信息学分析得出,TRX-h5基因编码118个氨基酸,相对分子质量为13122.32,理论等电点为5.19,该蛋白的不稳定参数为26.74,属于稳定性蛋白。点突变分析发现,TRX-h5的第39位和第42位半胱氨酸位点决定了该蛋白的催化活性,为进一步探究TRX-h5的蛋白功能和高等植物氧化还原系统的研究提供了新思路。

转反义trxs基因小麦籽粒蛋白组分的巯基含量与α-淀粉酶活性的关系

利用反义trxs基因特异引物,对扬麦5号转反义trxs基因株系00TY5的T4和T5代进行了PCR分子鉴定,并对其纯合株系籽粒蛋白质组分的巯基含量、α-淀粉酶活性及二者的相关性进行了测试。结果表明,00TY5的T4和T5代PCR分子检测均呈阳性。与非转基因植株相比,在籽粒成熟和后熟过程中,籽粒清蛋白巯基含量在开花后30 d至成熟后5 d平均降低33.2%,球蛋白巯基含量在开花后20 d至成熟后5 d平均降低42.5%,均达极显著水平(P<0.01);醇溶蛋白和谷蛋白巯基含量有下降的趋势,但降低幅度较小;α-淀粉酶活性低,变异小,尤其在开花后35 d至成熟后10 d,平均比非转基因植株下降36.5%。各种蛋白质组分的巯基含量与α-淀粉酶的活性呈正相关关系,清蛋白巯基含量在成熟前与α-淀粉酶活性相关性达极显著水平(P<0.01);球蛋白巯基含量在成熟前10 d至成熟后10 d达显著水平(P<0.05);贮藏蛋白巯基含量与α-淀粉酶活性的相关性在各时段均较高。

大麦转化体系的改进及TrxS基因的转化

以啤酒大麦品种"晋引6号"的幼胚为转化起始材料,用基因枪法将分别携带有目的基因(TrxS)和除草剂基因(筛选基因,Bar)的两个质粒进行了共转化,同时对基因转化的相关技术和植株再生的培养方案进行了优化。结果表明,受体材料宜选用预培养15d的幼胚;在培养前2周添加1mg/LABA可抑制胚芽萌发而且有助于胚性愈伤组织的形成;1.0mg/LZT与0.1mg/LIAA激素配比可有效促进愈伤组织的分化。利用优化的培养条件,经在含3～5mg/L筛选剂PPT的培养基上筛选、再生及生根培养。共在178块抗性愈伤组织上获得11株再生植株,再生率达到6.2%,经对T0、T1、T2代PCR、nestedPCR和Southern杂交检测表明,TrxS基因已经稳定整合到大麦基因组中且遗传稳定、结构完整。

Trxs基因对啤酒大麦籽粒灌浆后期抗氧化能力和荧光参数的影响

为了深入探索Trxs基因的功能,给转基因大麦育种提供理论依据,以啤酒大麦品种Harrington及其过量表达硫氧还蛋白S基因(Trxs)的转基因大麦株系为试验材料,对籽粒灌浆后期旗叶中还原型谷胱甘肽(GSH)含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、叶绿素荧光特性以及不同发育阶段籽粒中GSH含量和产量性状进行研究。结果显示:(1)籽粒灌浆后期转基因大麦旗叶GSH含量与APX活性显著高于非转基因对照;(2)花后15 d时各测定时间点和籽粒灌浆后期不同测定时间转基因大麦旗叶叶绿素荧光参数Fv/Fm与Fv/Fo值普遍高于对照;(3)转基因大麦的产量性状优于对照,其千粒重、单株穗数和单株产量平均分别比对照提高了12.29%、34.34%与41.01%。这些结果表明,Trxs通过影响旗叶和籽粒中GSH含量和旗叶中APX活性,提高了籽粒灌浆后期转基因啤酒大麦抗逆境胁迫的能力,改善了啤酒大麦转基因株系在籽粒灌浆后期的光合性能,有利于提高了单株产量。

黄芪桂枝五物汤对糖尿病大鼠周围神经组织Trx及Txnip表达的影响

目的:研究黄芪桂枝五物汤对STZ大鼠坐骨神经Trx及Txnip表达的影响,初步探讨黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变(DPN)的机制。方法:将链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠随机分为模型组、给药组,另取正常大鼠为对照组。8周后,采用Western blot法及实时荧光定量PCR法测定大鼠坐骨神经中Trx与Txnip表达。结果:Western bolt法显示模型组大鼠坐骨神经Txnip表达明显高于对照组(P<0.01),给药组低于模型组(P<0.01)。实时定量PCR法显示模型组大鼠坐骨神经Txnip表达明显高于对照组(P<0.01),给药组低于模型组(P<0.01)但高于对照组。而大鼠坐骨神经Trx表达中模型组明显低于对照组(P<0.01),给药组高于模型组(P<0.01)但低于对照组。结论:DPN大鼠坐骨神经存在Txnip系统异常,黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变,其作用机制与抑制Txnip表达,提高Trx表达有关。

反义TRX s基因对转基因小麦籽粒硫氧还蛋白还原活性的影响

以转反义TRX s基因小麦纯合系为材料,分析了转基因小麦TRX h活性和清蛋白、球蛋白、谷蛋白和麦醇溶蛋白各组分及其还原状态的变化。结果表明,不同成熟期转基因小麦籽粒和胚乳中TRX h活性平均比对照降低76.2%和14.2%,其籽粒中的清蛋白、球蛋白、麦醇溶蛋白和谷蛋白巯基含量平均比对照分别低41%、44%、14%和13%,胚乳中分别比对照低37%、17%、45%和6%,而不同成熟期转基因小麦籽粒和胚乳中4种蛋白组分含量比对照都相应提高。说明导入的反义TRX s基因对小麦TRX h基因表达有显著(P<0.05)的抑制作用,进而影响TRX h对各蛋白组分的还原作用,造成还原态蛋白组分(巯基含量)降低,被动员消耗的蛋白质数量减少,而各蛋白组分含量显著(P<0.05)高于对照。本研究结果为转反义TRX s基因小麦种子发芽延缓和抗穗发芽特性提供了直接的证据。

硫氧还蛋白(Trx)的研究进展

硫氧还蛋白Thioredoxin(Trx)是一类高度保守的低分子量蛋白质。Trx广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中。根据氨基酸序列的不同,Trx分为家族Ⅰ和家族Ⅱ2个家族。根据最初结构的不同,Trx家族Ⅰ又被分为6大类型:h,f,m,o,x和y。不同类型的Trx在不同生物以及细胞内的不同区域分布不同。硫氧还蛋白具有多种生物学功能,对维持体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。Trx具有调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录等功能。Trx还与植物抗逆性相关,如参与植物抗旱、耐热和抗氧化胁迫过程,调节抗逆基因的表达。因此,我们可以将硫氧还蛋白基因通过转基因技术导入植物体中,在植物遗传性状改良等方面具有广泛的应用前景。本文综述了硫氧还蛋白的类型、组织分布、生物学功能以及与植物抗逆性的关系。

反义TrxS基因在小麦中的表达及对小麦种子蛋白酶活性和蛋白组分的影响

为了揭示反义硫氧还蛋白基因(anti-TrxS)在抗穗发芽小麦中的作用机制,探讨转基因小麦中蛋白酶活性和蛋白组分的变化规律,以转反义TrxS基因小麦株系为材料,用荧光定量RT-PCR、SDS-PAGE和生理指标测定的方法,对转基因株系和对照种子萌发过程中反义TrxS基因表达、蛋白酶活性和蛋白组分进行了检测。结果表明,反义TrxS基因在RNA水平上能够表达;转基因小麦籽粒蛋白酶活性明显下降,种子吸涨12、24、48、729、6和120 h后,转基因小麦种子蛋白酶活性比对照分别降低27.3%、30.7%、19.1%、19.4%、23.7%和13.5%;转基因小麦籽粒谷蛋白、醇溶蛋白的SDS-PAGE分析表明,反义TrxS基因的导入抑制了转基因小麦籽粒谷蛋白和醇溶蛋白大分子亚基二硫键(S-S)向巯基(-SH)的转化,从而使蛋白质的降解延缓。

TrxS基因的表达及其对大麦种子淀粉酶活性的影响

【目的】分析TrxS基因对大麦种子发芽及淀粉酶活性的影响,为TrxS基因对大麦种子代谢的调控提供了理论依据。【方法】以转TrxS基因啤酒大麦株系为材料,从分子水平和生理指标进行分析。【结果】实时荧光RT-PCR检测证明TrxS基因在RNA水平上能够表达;转基因大麦籽粒α-淀粉酶和β-淀粉酶活性明显提高,发芽1-5d转基因大麦种子α-淀粉酶活性比对照分别增加5.86%、75.24%、118.51%、71.02%和22.99%,β-淀粉酶活性分别比对照增加19.29%、14.68%、35.47%、23.62%和2.67%;种子的发芽能力提高。【结论】TrxS基因能够促进种子发芽。

反义trxs基因对转基因小麦种子内源trxh基因表达的影响

以转反义硫氧还蛋白基因（anti-trxs）株系01TY70-1-17．5及其对照小麦品种‘豫麦70’为试验材料，以小麦中稳定表达的肌动蛋白基因actin为内标，用半定量反转录聚合酶链式反应（semi-QRT．PCR）方法，对转基因株系及其对照种子中trxh基因时空表达情况进行了检测。检测结果表明，花后15～30d转基因株系trxh基因转录量平均比对照下降了20．1％，花后25d显著低于对照（尸．〈0．05）；胚乳trxh基因转录量最低，平均比对照低19.4％；种子吸涨24h时间内，转基因株系trxh基因转录量较对照均略低，但差异不显著。表明，外源trxs基因的导入直接干扰了内源基因的表达。

转反义trxs基因对小麦种子萌发过程中淀粉水解酶的影响

检测转反义trxs基因小麦种子萌发过程中胚乳内α-淀粉酶、β-淀粉酶和支链淀粉酶活性变化的结果表明,在种子萌发4d内,转基因小麦3种酶的活性态酶活性均低于野生型小麦,而3种酶的抑制态酶活性则均高于野生型小麦,转基因小麦淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦,这可能是转基因小麦酶活性降低的原因之一。

转反义trxs基因对小麦种子α-淀粉酶活性的影响

通过PCR检测,转基因小麦植株均出现474 bp的目的带,说明反义trxs基因已整合到小麦基因组上。经 测定在种子萌动过程中转基因种子的α-淀粉酶活性低于未转基因种子,证明该基因能够正常表达,从而使转基因品 种具有抗穗发芽的能力。

FGF-2和TRX在非小细胞肺癌中的表达及临床病理学意义

目的探讨成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和硫氧还蛋白(TRX)在非小细胞肺癌(NSCL)组织中的表达及其相关性。方法应用免疫组织化学SP法分析76例非小细胞肺癌组织、15例非肺癌肺组织中FGF-2和TRX蛋白的表达水平。采用Western印迹、RT-PCR方法检测外源性FGF-2对人肺腺癌细胞株A549中TRX蛋白及mRNA表达水平的影响。结果非小细胞肺癌组织中FGF-2和TRX阳性率分别为65.8%(50/76)和72.3%(55/76),显著高于非肺癌肺组织(P<0.01),FGF-2和TRX阳性表达与淋巴结转移、临床分期密切相关(P<0.01),与年龄、性别及病理分型无关(P>0.05)。两者表达在NSCLC中呈正相关(P<0.01)。FGF-2可以上调A549细胞中TRX蛋白和mRNA的表达。结论 FGF-2和TRX在非小细胞肺癌发生与发展中具有重要作用,FGF-2可能通过TRX促进肺癌的发生与发展。

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒硫氧还蛋白(TRX)基因的克隆及生物信息学分析

首次从海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus-EhV99B1)中克隆了硫氧还蛋白(Trx)基因(该序列已提交GenBank,登录号:GU109280)。系统进化关系分析表明:EhV99B1-Trx与GenBank中已报道的EhV86-Trx(NC_007346)有很高的同源性,核酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为98%和100%,而与其它物种的Trx序列同源性仅为9.8%-18.8%。采用生物信息学方法和工具分析了EhV99B1-Trx的生化参数,预测了该蛋白的高级结构。结果表明:(1)EhV99B1-Trx基因的开放阅读框全长591bp,编码196个氨基酸,蛋白的相对分子量为22.1kDa,理论等电点为5.27;(2)EhV-99B1-Trx N端蛋白结构域具有保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序;(3)对该蛋白二、三级结构分析预测结果进一步证实EhV99B1-Trx基因编码的为一种新型的硫氧还蛋白家族成员。

转trxS基因大麦发芽种子水解酶活性的变化(英文)

利用转基因技术是改良大麦品种品质的有效途径。研究了转trxS基因对大麦种子发芽过程中水解酶活性的影响,结果表明转基因种子中α-淀粉酶、自由态β-淀粉酶和极限糊精酶的活性比未转基因种子高;转基因种子醇溶蛋白和谷蛋白中巯基的含量提高,说明该基因能够表达,为大麦育种和品质改良提供新的途径。

反义trxs基因导入对小麦籽粒脱支酶活性的影响

以转反义硫氧还蛋白基因株系01TY34-73-9及其对照品种‘豫麦34’为材料,运用PCR检测和酶活性测定的方法,对转基因株系遗传稳定性以及转基因与对照种子中脱支酶活性进行测定。结果显示:(1)外源基因已经稳定遗传至后代;(2)转基因种子在不同成熟时期和不同萌发过程中的脱支酶活性与对照相比均有不同程度的降低平均降低10.3%,但仅花后25 d到收获后5 d脱支酶活性显著低于对照,其中最低值出现在花后30 d,平均比对照下降了12.0%;(3)在花后30 d和后熟5 d萌发过程中,转基因种子脱支酶活性始终低于对照,平均下降6.2%和22.2%。表明反义trxs基因的导入干扰了小麦trxh基因的表达,使trxh转录量减少,小麦籽粒中脱支酶的活性受抑。