松油烯4醇的抑菌性及促进MC3T3-E1细胞成骨分化作用

背景:有研究发现,松油烯4醇对于种植体周围炎相关致病菌表现出明显的抑菌活性,当应用于钛种植体表面时能有效减少表面生物膜形成,降低种植体周围炎的发生,但是有关其生物安全性的研究不多。目的:分析松油烯4醇对金黄色葡萄球菌、变异链球菌的抗菌效果,以及其对MC3T3-E1细胞生长与成骨分化的影响。方法:将松油烯4醇以不同体积分数溶于二甲基亚砜中,检测松油烯4醇溶液对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的最低抑菌浓度及最低杀菌浓度,并采用抑菌圈实验检测1/2最低抑菌浓度、最低抑菌浓度及最低杀菌浓度松油烯4醇的抗菌效果。以不同浓度(0%,0.3%,0.2%,0.1%,均为体积分数)松油烯4醇的培养基或钙化诱导液处理MC3T3-E1细胞,采用CCK-8实验检测细胞的增殖活性,罗丹明-鬼笔环肽染色观察细胞骨架,碱性磷酸酶活性实验检测细胞分化能力,茜素红染色观察矿化结节形成,RT-PCR检测Runx2、骨钙素mRNA的表达。结果与结论:①松油烯4醇溶液对变异链球菌的最低抑菌浓度为0.1%、最低杀菌浓度为0.4%,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.03%、最低杀菌浓度为0.125%;随着浓度的增加,松油烯4醇溶液对两种细菌的抑菌圈直径增加(P<0.05);②CCK-8实验显示,松油烯4醇可促进MC3T3-E1细胞的增殖,其中以浓度0.2%组最明显;③罗丹明-鬼笔环肽染色显示,松油烯4醇可促进MC3T3-E1细胞的黏附;④碱性磷酸酶活性与茜素红染色显示,松油烯4醇均可促进MC3T3-E1细胞的早期分化与矿化,其中以浓度0.2%组最明显;⑤RT-PCR检测显示,钙化诱导1 d时,0.3%,0.2%,0.1%组Runx2 mRNA的表达高于0%组(P<0.05);钙化培养7,14 d时,0.2%,0.1%组Runx2、骨钙素mRNA的表达高于0.3%,0%组(P<0.05);⑥结果表明,松油烯4醇可以抑制金黄色葡萄球菌及变异链球菌的生长,促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化。

高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在S.suis细胞中的定位。生长曲线结果显示,S.suis融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P<0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在S.suis的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到PBP1b在S.suis中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在S.suis细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。

葡萄柚漱口液对变异链球菌抗菌机制的研究

目的:研究葡萄柚漱口液对变异链球菌的抗菌活性,初步探讨其抗菌机制。方法:采用液体稀释法测定葡萄柚漱口液对变异链球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);同时扫描电镜下观察葡萄柚漱口液对变异链球菌细胞壁的影响。结果:葡萄柚漱口液对变异链球菌的MIC为46.875 mg/L,MBC为93.75 mg/L。扫描电镜观察显示,葡萄柚漱口液处理后的变异链球菌出现细胞壁破裂,内容物溢出。结论:葡萄柚漱口液对体外培养的变异链球菌有明显的抑制和杀灭作用,其抑制机制可能与葡萄柚提取物破坏细胞壁结构的完整性有关。

柠檬精油、柠檬烯、茶多酚对变形链球菌表面疏水性及黏附的影响

目的:研究天然植物成分柠檬精油(LEO)、柠檬烯(LIM)及茶多酚(TP)对变形链球菌(S.mutans)细菌表面疏水性及黏附能力的影响。方法:取最小抑菌浓度(MIC)以下浓度作为实验浓度;采用微生物黏着碳氢化合物法(MATH),测定S.mutans表面疏水性;采用96孔板结晶紫染色法,评价S.mutans的黏附。结果:LEO、LIM、TP在低于最小抑菌浓度(MIC)时,对S.mutans表面疏水性及粘附具有抑制作用;在一定范围内其抑制作用随浓度增大而逐渐增加(P<0.05);1/2 MIC和1/20MIC时LEO抑制表面疏水性的作用强于LIM和TP(P<0.05)。结论:LEO具有防龋应用前景。

破壁方法对嗜热链球菌SP1.1胞内乳糖代谢关键酶活性的影响及其条件优化

通过超声波破壁法、溶菌酶破壁法、反复冻融法和机械破壁法4种不同破壁方式对嗜热链球菌SP1.1进行破壁处理,对菌体的破壁率、提取的β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶两种胞内酶的活力进行分析比较,以确定适合于嗜热链球菌细胞破壁方法及其最佳条件。结果表明:这4种菌体细胞破壁效果存在很大差异,其中经溶菌酶处理胞内酶提取效果最好,破壁率可达99.87%,β-半乳糖苷酶酶活力为0.387U,乳酸脱氢酶酶活力为2.375U,与其他3种方法的破壁效果差异极显著(P<0.01)。优化溶菌酶破壁条件,当处理8mL菌浓度为1.3×109CFU/mL的样品时,确定处理最佳温度为37℃,时间为30min,酶(20000U/mL)用量为1mL,此时破壁率可达99.99%,β-半乳糖苷酶酶活力为0.429U,乳酸脱氢酶酶活力为2.431U。

变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区真核表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区的真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法:利用基因重组技术构建真核表达质粒pVAX1-Gb-pA/GBD,经酶切分析和测序分析鉴定后,通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达。结果:重组质粒pVAX1-GbpA/GBD经EcoR I和BamH I酶切证实携带1.2kb目的基因片段,经测序分析,目的基因正确插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-gbpA/GBD转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。结论:成功构建防龋基因疫苗真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。

高龋及无龋儿童变形链球菌分离株的蔗糖粘附能力比较

目的:探讨高龋和无龋儿童变形链球菌(变链菌)临床分离株的蔗糖依赖性粘附能力。方法:选取本实验室从10例高龋儿童和10例无龋儿童(3￣5岁)牙菌斑内分离、鉴定所得的60株变链菌临床分离株进行研究。采用紫外分光光度计,检测来自高龋儿童(dmfs≥6)的39株和无龋儿童(dmfs=0)的21株变链菌在含糖培养基中对玻壁的粘附情况。采用SPSS12.0软件包进行单因素方差分析,比较高龋儿童和无龋儿童之间牙菌斑内变链菌分离株的玻壁粘附能力。结果:在含1%蔗糖的培养基中,高龋组变链菌分离株对玻壁的粘附比平均值为(55.49+26.16)%,无龋组变形链球菌分离株对玻壁的粘附比平均值为(27.01+18.39)%,2组间差异具有显著性,P<0.01。结论:在含蔗糖环境中,分离自高龋儿童牙菌斑的变链菌株对玻壁的粘附能力高于来自无龋儿童的变链菌分离株,提示变链菌临床分离株的粘附能力与其致龋力相关。

噻唑蓝比色法检测变异链球菌、血链球菌、伴放线菌嗜血菌的研究

目的探讨噻唑蓝(MTT)法用于口腔常见细菌(变异链球菌、血链球菌、伴放线菌嗜血菌)活菌计数的可行性及具体应用过程中的实验条件。方法本实验以菌落形成单位(CFU)法为标准对照。实验通过改变比色的波长、反应时间、试剂剂量、细菌菌龄等实验条件,获得MTT法测量常见口腔细菌的一系列参数,对变异链球菌、血链球菌、伴放线菌嗜血菌进行活菌计数,并与CFU法所测的细菌数量相比较。结果 MTT法在测量变异链球菌时,最佳的检测波长为510nm,最佳的测定细菌范围是1.5×105～1.0×107CFU·mL-1。MTT法在测量血链球菌时,最佳的检测波长为545nm,最佳的测定细菌范围是1.5×105～2.0×107CFU·mL-1。MTT法在测量伴放线菌嗜血菌时,最佳的检测波长为557nm,最佳的测定细菌范围是1.0×106～5.0×107CFU·mL-1。MTT法与菌落形成单位法的测量结果是一致的,并且对于不同菌龄的变异链球菌、血链球菌、伴放线菌嗜血菌均适用。结论 MTT法可以用于检测变异链球菌、血链球菌、伴放线菌嗜血菌等口腔常见细菌的活菌数量,并且具有快速、方便等优点。

壳寡聚糖对变形链球菌影响的电镜观察

[目的]研究壳寡聚糖对变形链球菌细胞壁结构的影响,探讨壳寡聚糖对变形链球菌产生抑制作用的可能机制。[方法]选择变形链球菌S.mutansATCC25175作为实验菌株,实验分壳寡聚糖处理组及空白对照组,厌氧环境(80%N2、10%H2、10%CO2)下培养24h,使用扫描电镜及透射电镜分别观察变形链球菌细胞表面和细胞壁及细胞内部的变化情况,了解壳寡聚糖对变形链球菌结构的影响。[结果]扫描电镜观察显示壳寡聚糖处理后的变形链球菌细胞表面有凹陷及内容物溢出等表现,而透射电镜观察显示壳寡聚糖使变形链球菌细胞壁的完整性被破坏,胞浆内有空泡形成。[结论]本实验结果提示壳寡聚糖可能通过影响变形链球菌细胞壁结构和功能的完整性而产生抑制作用。

MTT法测量血链球菌的应用

目的探索MTT法用于血链球菌(S.sanguis)活菌计数的可行性及具体应用过程中的实验条件。方法以菌落形成单位法为标准对照。实验通过改变比色的波长、反应时间、试剂剂量、细菌菌龄等实验条件,获得MTT法的一系列参数,对S.sanguis进行活菌计数,并与菌落形成单位法所测的细菌数量相比较。结果MTT法与菌落形成单位法的测量结果是一致的,并且对于不同菌龄的S.sanguis均适用。结论MTT法可以用于检测S.sanguis的活菌数量,并且具有快速、方便等优点。

嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG的构建及表达研究

目的:构建含变异链球菌表面蛋白Spa P的P区编码基因spap-P和葡聚糖结合蛋白Gbp A的葡聚糖结合区编码基因gbd的嵌合体真核表达质粒p VAX1-SPG,并观察其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法:通过基因工程技术构建嵌合体真核表达质粒p VAX1-SPG,并采用脂质体转染法将其转染至293T细胞中;然后分别采用免疫组化SABC法和Western-blot检测嵌合蛋白Spa P/P-GBD在真核细胞中的表达。结果:重组真核表达质粒p VAX1-SPG经酶切、测序鉴定证实,其所携带的外源基因片段为2.4 kb的目的基因片段,序列同源性为99%;免疫组化染色结果显示,经p VAX1-SPG转染的293T细胞胞质呈棕褐色染色;Western-blot检测结果显示,分子量为72 k Da的嵌合蛋白Spa P/P-GBD能够被正确表达。结论:构建成功的嵌合体真核表达质粒p VAX1-SPG能在真核细胞293T中正确表达目的蛋白。

变形链球菌超声提取物对牙髓细胞增殖和天然免疫受体基因mRNA表达的影响

目的:观察变形链球菌超声提取物对牙髓细胞的增殖活性、天然免疫受体基因mRNA表达的影响。方法:采用组织块法原代培养牙髓细胞,通过不同浓度的变形链球菌超声提取物(1、10、100μg/ml)作用于牙髓细胞,MTT法检测牙髓细胞的增殖活性;荧光定量PCR检测牙髓细胞NOD2、TLR2和TLR4 mRNA的表达水平。结果:1μg/ml变形链球菌超声提取物处理24 h可促进牙髓细胞的增殖;10μg/ml和100μg/ml处理24 h和48 h可明显抑制细胞增殖。变形链球菌超声提取物(10μg/ml)作用于牙髓细胞后,NOD2、TLR2和TLR4 mRNA表达量均增加。结论:变形链球菌超声提取物可抑制牙髓细胞的生长,促进NOD2、TLR2和TLR4 mRNA的表达。

猪链球菌2型新的感染相关因子自溶素的鉴定与分析

根据Sanger研究所公布的猪链球菌2型(SS2)P1/7株的自溶素序列,设计检测引物,取SS2我国2次流行株、其它临床分离株和参考株,及猪链球菌1型、1/2型、7型和9型,共33株,分别以其DNA为模板,PCR扩增。结果表明,SS2除无毒株T15阴性外,其他临床分离株27株(含人源2株)均阳性;其它猪链球菌为,SS7阳性,SS1、SS1/2和SS9均阴性。同时设计引物向两侧扩增,以四川流行株ZY05719和江苏流行株HA9801的DNA为模板,扩增自溶素ORF完整的编码基因,软件分析结果显示,该基因含有6个重复的"GBS_Bsp-like"域和1个"N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶"域,与SS2欧洲株有较高同源性(99.8%),但与SS2加拿大株差异较大。在DNASTAR分析所编码蛋白的抗原性的基础上,另设计引物,以ZY05719株DNA为模板,PCR扩增具有良好免疫原性的片段基因,并定向克隆至表达载体pET30a(+)中,进行重组表达,SDS-PAGE和Western blot表明,所获得重组自溶素具有良好反应原性。

不同处理方法对肺炎链球菌基因组提取的影响

为了获得简便、高效的提取肺炎链球菌基因组DNA方法,分别采用不同处理方法(溶菌酶法和脱氧胆酸钠(DOC)法)、不同处理时间对8株不同血清型的肺炎链球菌进行破壁,同时菌株采用不同培养时间进行基因组的提取,提取基因组后利用紫外分光光度计测定样品中DNA的浓度和纯度以及琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。结果表明,菌株培养12~16 h、质量分数1%DOC处理2 h能提取出高质量的肺炎链球菌基因组DNA。该方法提取的肺炎链球菌基因组DNA具有质量高、完整性好的优点,为肺炎链球菌全基因组序列的测定提供了前提条件。

用生物信息学方法预测2型猪链球菌98HAH33细胞壁结合蛋白

目的为预测已公布基因组序列的2型猪链球菌(SS2)98HAH33株的细胞壁结合蛋白,以研究它们在SS2致病过程中的作用。方法首先从GenBank获取由SS28HAH33基因组推测蛋白质氨基酸序列,然后根据分选酶底物的结构特征,采用"三部分模式"法鉴别分选酶底物;采用手动方法寻找在具有I型信号肽的蛋白质中具有LysM域、WxL域、胆碱结合域、GW域或S层同源域的蛋白质;利用InterProScan和BlastP服务器,对鉴定的蛋白质进行功能分析。结果共预测出9种分选酶底物,2种具有LysM域的蛋白。YP_001201232、YP_001201531和YP_001201656等3种已证实位于SS2菌体表面;其中YP_001201232为已知毒力因子OSF。另外4种蛋白质的功能分析表明,YP_001201484为糖苷酶,YP_001201544为枯草杆菌素样丝氨酸酶,YP_001199825和YP_001199755可能结合H因子,可能为新的毒力因子。YP_001200959、和YP_001201233等2种功能未知。结论提示SS2的多数分选酶底物可能为SS2的毒力因子,与致病过程相关。

变异链球菌UA159细胞壁蛋白的预测和功能分析

[目的]对变异链球菌UA159细胞壁蛋白进行预测和功能分析,为后续研究该菌致病机制奠定基础。[方法]用Phobius和Signal P 4.0软件预测变异链球菌UA159的细胞壁蛋白,并采用COG功能数据库对细胞壁蛋白进行功能注释。[结果]变异链球菌UA159共含有22个细胞壁蛋白,其中含有LPx TG锚定基序的有12个,含有Lys M基序的有3个,含有CW基序的有5个,含有GW基序的有1个,含有PG锚定基序的有1个。功能分析结果显示,22个细胞壁蛋白中有18个蛋白没有具体的功能注释,4个蛋白有具体的功能注释,其中beta-lactamase与防御机制功能有关;exo-beta-D-fructosidase与碳水化合物代谢与转运有关;分子伴侣蛋白ATP-dependent protease Clp E与蛋白质翻译后修饰和蛋白质折叠有关;cell wall-associated protein Wap A与细胞壁和细胞膜的生物合成有关。[结论]变异链球菌UA159全基因组大多数的细胞壁蛋白功能未知,需在以后研究中进行进一步的功能注释。

变形链球菌重组表面蛋白(rA-P)人源单链抗体的筛选及其活性检测

目的从PDNA5噬菌体抗体库中筛选变形链球菌重组表面蛋白的人源噬菌体单链抗体,将其表达制备非融合单链抗体,并探讨其生物学特性。方法用变形链球菌重组表面蛋白rA-P包被免疫试管,对pDAN5噬菌体抗体库进行5轮亲和免疫筛选制备抗rA-P蛋白的噬菌体单链抗体,并将其感染大肠杆菌HB2151,用IPTG诱导表达非融合性单链抗体,非融合性单链抗体包涵体复性后用Western blot检测其生物活性。结果筛选得到13株抗rA-P蛋白的噬菌体单链抗体;用HB2151表达的非融合性单链抗体分子量为30kD,表达量达菌体蛋白的30%,Western blot检测显示,复性后的非融合性单链抗体能与rA-P蛋白发生特异性抗原抗体反应,证明表达的非融合性单链抗体有生物活性。结论成功地利用噬菌体抗体库技术筛选、表达制备有生物活性的抗变链菌表面蛋白的人源单链抗体。

2型猪链球菌细胞壁蛋白SSU1664的表达、纯化及活性分析

目的:从猪链球菌05ZY中扩增SSU1664基因,在大肠杆菌中表达并评价其重组蛋白的活性。方法:根据05ZY基因组序列设计引物,PCR扩增SSU1664基因,构建表达载体,利用亲和层析对目的蛋白进行纯化,Western blot和ELISA法鉴定其免疫原性。结果:SSU1664基因能够在大肠杆菌中可溶性表达,Western blot显示其能与猪链球菌菌体免疫后的大鼠血清反应,ELISA检测显示在人感染猪链球菌患者血清中针对SSU1664蛋白的IgM含量显著性升高。结论:SSU1664蛋白具有较高的免疫原性,可作为潜在的猪链球菌疫苗候选分子和猪链球菌早期感染诊断的标志物。

变形链球菌对EAhy926细胞Toll样受体2和4及白细胞介素6和8表达的影响

目的观察变形链球菌对EAhy926细胞Toll样受体2和4的表达及炎性细胞因子白细胞介素6和8分泌的影响,初步探讨Toll样受体表达与细胞因子产生之间的关系。方法变形链球菌作用于EAhy926细胞,RT-PCR法检测EAhy926细胞Toll样受体2和4及白细胞介素6和8的mRNA表达;流式细胞术检测EAhy926细胞表面Toll样受体2和4的表达;细胞生物活性法和ELISA分别检测EAhy926细胞白细胞介素6和8的分泌;抗体阻断实验观察Toll样受体2和4的表达与白细胞介素6和8产生间的关系。结果将变形链球菌作用于EAhy926细胞6 h,Toll样受体2和4的mRNA表达与加入的细菌量呈一定的剂量依赖关系,以细菌与细胞作用比例为100∶1时,Toll样受体2和4的mRNA表达量最高(P<0.05)。变形链球菌能诱导EAhy926细胞(100∶1)Toll样受体2和4的mRNA和蛋白水平表达增强,在6 h达到高峰,12 h后又逐渐下降(P<0.01);白细胞介素6和8的表达量也增加,在12 h达最大表达量(P<0.05)。经Toll样受体2和Toll样受体4抗体阻断后,变形链球菌诱导EAhy926细胞白细胞介素6和8的mRNA表达明显减少(P<0.01)。结论变形链球菌可上调EAhy926细胞Toll样受体2和4的表达,促进炎性细胞因子白细胞介素6和8的产生;白细胞介素6和8的产生与Toll样受体2和4的表达上调密切相关。

变形链球菌对EAhy926细胞TLR2 mRNA表达的影响

目的:观察变形链球菌细胞壁及培养上清对人血管内皮细胞EAhy926细胞的TLR2mRNA表达影响。方法:不同剂量的变形链球菌细胞壁或培养上清作用于EAhy926细胞,RT-PCR法检测EAhy926细胞TLR2mRNA的表达。结果:变形链球菌细胞壁作用于EAhy926细胞后,TLR2mRNA的表达量随着作用时间延长而逐渐增高,于16～24h达到高峰,以后又逐渐下降(P<0.01);变形链球菌培养上清作用于EAhy926细胞后,TLR2mRNA的表达量不随着作用时间和作用浓度而发生变化。结论:变形链球菌细胞壁可明显上调EAhy926细胞TLR2mRNA的表达,并呈时间和剂量依赖性;变形链球菌培养上清不能刺激EAhy926细胞TLR2mRNA的表达。