金银花花形基因的发掘及生物信息学分析

金银花作为我国重要的中药材,具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、防癌等多种功效。随着金银花市场供需矛盾日益加剧,通过分子标记辅助选择育种方法来培育高产优质品种势在必行。通过NCBI的Blast工具扫描金银花蛋白组数据发掘花形候选基因,并执行候选基因的亲缘关系分析、结构域分析、表达模式分析、理化性质分析、蛋白质结构预测等一系列生物信息学分析。依据拟南芥调控花形的ABE类基因,通过NCBI-Blast工具扫描金银花氨基酸序列,筛选出包含MADS结构域的8个调控花形的金银花候选基因。经LjaFGD表达模式分析发现,金银花的花中GWHGAAZE016592和GWHGAAZE014905表达量显著高于其他部位,可能正向调控金银花花形。GWHGAAZE014905是一个包含MADS结构域的调控花器官发育的B类基因;GWHGAAZE016592是AP3同源基因。生物信息学分析发现,GWHGAAZE016592和GWHGAAZE014905均是稳定的亲水蛋白,属于非分泌蛋白,包括Motif1、Motif3、Motif4、Motif2、Motif6和Motif5,蛋白质三级结构模板为6byy.2.A和4ox0.2.C。GWHGAAZE014905被定位到细胞核上,而GWHGAAZE016592被定位到叶绿体上,且包含1个位于151~173 bp的跨膜螺旋区域,属于膜蛋白。研究结果为分子标记辅助选择方式培育道地高产优质金银花品种提供了基因资源和分子标记。

忍冬花蕾化学成分研究

目的 :对忍冬花蕾化学成分进行研究 ,寻找抗菌活性化合物。方法 :采用溶剂分配法、硅胶柱层析进行成分提取、分离。运用UV ,IR ,MS ,1 H NMR ,1 3C NMR及标准品对照等 ,结合文献对比确定其结构 ,并进行抗菌活性药理实验。结果 :从忍冬花蕾中分离得到 11个化合物 ,分别是木犀草素 (I)、5 羟基 7,3′,4′ ,5′ 四甲氧基黄酮(Ⅱ )、5 羟基 7,3′,4′ 三甲氧基黄酮 (Ⅲ )、5 羟基 7,4′ 二甲氧基黄酮 (Ⅳ )、槲皮素 (Ⅴ )、忍冬苷 (Ⅵ )、5 ,7,3′ ,4′ 四羟基黄酮醇 3 O β D 葡萄糖苷 (Ⅶ )、3 O [α L 鼠李吡喃糖基 (1→ 2 ) α L 阿拉伯吡喃糖基 ] 2 8 O [β D 葡萄吡喃糖基 (1→ 6 ) β D 葡萄吡喃糖基 ]齐墩果酸 (Ⅷ )、绿原酸 (Ⅸ )、胡萝卜苷 (Ⅹ )、蔗糖 (Ⅺ )。 结论 :化合物Ⅳ为首次从该属植物中发现 ,化合物Ⅴ ,Ⅵ ,Ⅷ和Ⅹ为首次从该植物的花蕾中发现 ,一些化合物显示较强的抗菌活性。

金银花的抗腺病毒作用研究

目的 :研究四个产地三种金银花的抗腺病毒作用。方法 :通过体外病毒敏感性试验 ,对不同方法提取的金银花浸膏进行了药效实验。结果和结论 :金银花醇提取液、水提取液。

大孔吸附树脂分离纯化金银花中总有机酸的研究

目的研究大孔吸附树脂富集、纯化金银花中总有机酸的工艺条件参数。方法以静态饱和吸附量、静态洗脱率为考察指标,比较了6种大孔吸附树脂分离、纯化金银花总有机酸的工艺。以总有机酸收率和质量分数为指标,对最佳树脂吸附工艺条件进行了筛选。结果在考察的6种树脂中,HPD100型树脂具有最佳的吸附及洗脱参数。结论本实验所筛选出的HPD100型树脂综合性能较好,适于金银花总有机酸的分离纯化。

赤霉素对金银花成花过程的调控

为了给金银花（Lonicera japonica Thunb．）栽培管理提供科学依据，试验分别研究了质量浓度为0（对照），100，300，500和1000mg／kg赤霉素对金银花花期、单株产量及品质的影响。结果表明，与对照相比，在金银花叶片完全展开且花芽分化前喷施100～1000mg／kg赤霉素，可以使金银花的始花期提前4～6d，盛花期提前8～10d，从而使金银花的采收期提前；喷施不同质量浓度的赤霉素使金银花单株产量提高了3．6～9．0g，千蕾重提高1．73～5．45g，花蕾长度增加0．49～1．39cm，金银花中绿原酸含量提高6．4～13．0g／kg。其中3001000mg／kg赤霉素处理明显提高了金银花的品质和产量。故在金银花成花调控过程中，赤霉素的最佳质量浓度为300～1000mg／kg。

HPLC法同时测定忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸含量

建立了HPLC法测定忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸含量的方法。应用Shim-pack ODS色谱柱(4.6×250 mm,5μm),乙腈/0.2%甲酸水梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长为350 nm。在此色谱条件下,各组分在30 min内均得到良好分离。用该方法测定了3个品种忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸的含量,结果表明亚特、意大利和九丰一号忍冬叶中木犀草苷含量分别为5.856、2.454和4.633 mg·g-1,明显高于花。

金银花花色素的种类和含量的研究

[目的]研究金银花各花期花色素种类和含量的变化。[方法]通过对不同花期金银花进行了特征显色反应、紫外-可见光谱扫描分析和花色素含量的测定,分析了金银花各花期花色素的种类和含量的变化。[结果]金银花不同花期的花色素由类黄酮、叶绿素和类胡萝卜素三大类组成,类黄酮中仅含有黄酮、邻二酚羟基;米蕾期到金花期,叶绿素含量逐渐下降,类胡萝卜素、黄酮类色素含量总体呈上升趋势,导致花色由白到黄的变化。[结论]该研究为金银花花色变化提供了理论依据。

多效唑和缩节胺对现蕾前忍冬枝叶生长及花蕾性状和有效成分含量的影响

以忍冬品种‘九丰一号’(Lonicera japonica‘Jiufeng 1’)为实验材料,采用叶面喷施方法研究了不同质量浓度多效唑和缩节胺对现蕾前(抽枝生长初期)枝叶生长和叶片叶绿素含量以及花蕾性状和花蕾中绿原酸和总黄酮含量的影响。结果显示:分别喷施100、400、700和1 000 mg·L-1多效唑和50、100、150和200 mg·L-1缩节胺后,多数处理组的开花枝条数、着花节数和叶绿素含量较对照CK1(水)有不同程度提高,但叶面积差异不明显。随处理时间延长,各处理组枝条节间长度总体上呈逐渐增加的趋势,其中多数处理组枝条节间长度增长缓慢。各处理的花蕾长度、百蕾鲜质量和干质量总体上小于CK1,而花蕾折干率、总黄酮含量和绿原酸含量显著或不显著高于CK1。此外,在喷施多效唑和缩节胺的同时喷施质量体积分数1.0%尿素和质量体积分数0.1%硼砂,忍冬的叶面积、着花节数、花蕾长度、折干率、百蕾鲜质量和干质量总体上有所提高,而绿原酸含量降低,但各指标的差异总体较小。研究结果表明:喷施适量多效唑和缩节胺可调控忍冬枝条生长,并能提高花蕾中总黄酮和绿原酸含量。

金银花开花与繁育特性研究

通过田间观察和人工授粉等方法,对金银花的开花生物学和繁育特性进行了研究。结果表明,金银花盛花期在5月中旬至8月中旬。金银花花序为总状花序,开花顺序自下而上,多数花在8∶00～12∶00开放,开花时花药随之开裂,花冠颜色由绿色逐渐变为白色,枯萎时变为金黄色。单花期约15 d,花粉寿命为3 d,活力最大时达到72.5%。柱头在开花当天具有较大可授性。金银花花粉与柱头的有效可遇期为2 d,可同花自交。综合花粉/胚珠比、OCI值、人工授粉判断金银花属于兼性异交型。本试验还对金银花育种中适宜采用的杂交技术及育种途径进行了探讨。

金银花茎中绿原酸和黄酮类化合物含量测定

采用分光光度法对金银花茎中的绿原酸及黄酮类化合物的含量进行了测定。结果表明，含量较高，具有开发利用的药用价值。

不同发育期忍冬花颜色与气味变化

目的研究忍冬Lonicera japonica Thunb.花不同发育期颜色、气味的变化。方法采用色差仪测定不同发育期忍冬花蕾或花颜色,通过气相离子迁移谱测定气味。结果不同生长发育期的忍冬花蕾或花的L~*值(亮度)呈现先升高后降低的趋势,a~*值(红绿色度)逐步升高,但二白期和金花期均有稍下降趋势;b~*值(黄蓝色度)除金花期稍有下降外,整个生长发育期均稳步增大;BI值(褐变指数)逐渐升高,金花期稍有下降;忍冬花蕾或花在发育过程中,挥发性成分有的增加、有的降低、有的从有到无、有的从无到有。结论该方法稳定可靠,可作为药材成熟度的鉴定指标。

金银花花器官实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选金银花花器官基因表达分析的适宜内参基因,试验以金银花花器官6个时期为材料,选取金银花的9个候选内参基因Lonja.ACT11,Lonja.ACT2/7,Lonja.G6PD,Lonja.GAPDH,Lonja.MTP,Lonja.TUA,Lonja.UBQ10,Lonja.EF1A,Lonja.UBC,利用q RT-PCR技术及Ge Norm,Norm Finder软件对它们的表达稳定性进行分析评价。结果表明,Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD在金银花花器官生长的不同时期表达水平较稳定,运用q RT-PCR研究金银花花器官基因表达时可选用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD组合作为内参基因。

不同品种山银花花期有效成分含量研究

[目的]对4个广西本地山银花药材的质量及从河南引种的1个金银花品种(对照)进行品质评价,研究不同品种山银花不同采收期与有效成分含量的关系,为广西山银花资源合理开发和综合利用提供依据。[方法]采收4个品种山银花白蕾期、银花期、金花期的花器官进行处理,采用高效液相色谱法,分别测定其木犀草苷、绿原酸、氨基酸总量等有效成分含量。[结果]对比4个品种山银花不同花期的有效成分含量,其中木犀草苷含量和氨基酸总量最高的是红-RD,分别达0.023%和13.000%,但低于对照品种;木犀草苷含量最低的是HX-RD,仅为0.001%;氨基酸总量最低的是MH-RD,为8.240%;绿原酸含量最高的是HN-RD,达6.587%;最低的是MH-RD,仅为2.400%;不同品种之间的有效成分含量呈现显著差异。从不同采收期来看,白蕾期的氨基酸含量均最高,木犀草苷含量不同采收期差异不显著,绿原酸不同采收期含量差异水平不一。[结论]作为广西乡土品种,红-RD和HN-RD的有效成分含量高,有很好的培育价值;对照品种H-RD(河南引进)是优良的金银花品种,适合在广西栽培;山银花最佳采收期为白蕾期,其有效成分含量最高,品质最好。

3个品种金银花不同器官中3种有效成分的比较

目的比较3个品种金银花不同器官(花蕾、茎枝、叶片)中3种有效成分(绿原酸、木犀草苷、花青素)的含有量。方法金银花50%甲醇、5%HCl-甲醇提取物的分析采用LaChrom C_(18)色谱柱;流动相乙腈-0.1%磷酸,梯度洗脱;绿原酸与木犀草苷检测波长为327 nm、花青素检测波长为525 nm。结果绿原酸含有量在"亚特红"金银花植株的第1、2花、茎枝和叶片含有量依次为4.48%、3.21%、3.79%、2.34%,"亚特青蕾"中含有量依次为3.29%、2.58%、3.00%、1.70%,忍冬含有量依次为3.26%、2.46%、2.63%、1.43%;木犀草苷含有量"亚特红"金银花依次为0.15%、0.09%、0.26%、0.43%,"亚特青蕾"中含有量依次为0.10%、0.09%、0.26%、0.21%,忍冬含有量依次为0.10%、0.06%、0.13%、0.14%;花青素含有量"亚特红"金银花依次为0.69、0.57、0.80、1.79 mg/g,"亚特青蕾"中含有量依次为0.14、0.07、0.23、0.30 mg/g,忍冬含有量依次为0.15、0.07、0.25、0.35 mg/g。结论 "亚特红"金银花在西北地区生长良好,且其叶片具有极高的开发利用价值,为西北地区扩大金银花种质资源,改善生态环境方案提供数据支持。

金银花开花过程中花瓣几种酶活性的变化

[目的]研究金银花开花过程中花瓣几种酶活性的变化。[方法]以金银花不同花期(米蕾期、三青期、二白期、大白期、银花期、金花期)的花朵为试验材料,研究金银花开花过程中可溶性蛋白质和丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的变化。[结果]在金银花开花过程中,随着花瓣可溶性蛋白质含量的下降,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性也随之下降;从银花期到金花期,随花色的变化,丙二醛(MDA)含量逐渐增加。[结论]该研究可为金银花花色变化的生理机制研究提供科学依据。

不同发育时期忍冬花酚酸类成分含量变化

目的比较不同发育时期忍冬花酚酸类成分含量,评估忍冬花在不同发育时期的药用价值,为确定适宜采收期提供参考。方法高效液相色谱电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)测定12种酚酸类成分含量,多元统计分析忍冬花不同发育时期酚酸类成分含量差异。结果忍冬花酚酸类成分总含量高低为二白期>三青期>大白期>米蕾期>银花期>金花期。结论不同发育时期忍冬花酚酸类成分含量差异显著,开放花中原儿茶酸和绿原酸甲酯含量较高,提示开放花具有独特的开发利用价值。

金银花不同提取物的红外光谱

利用红外光谱的宏观指纹特性,对金银花中不同溶剂提取物的红外光谱图和二阶导数红外光谱图进行了整体分析。初步推测,金银花石油醚提取物中主含长链脂肪酸(酯)、小分子萜类等低极性化合物。乙酸乙酯提取物主含环烯醚萜及其苷类化合物,无水乙醇和95%乙醇提取物中主含咖啡酸类衍生物和黄酮(苷)类化合物,去离子水提取物中主含鞣质及多糖类成分。综合比较亦可知,金银花醇提取物中的主成分是以绿原酸为代表的咖啡酸类衍生物。可见,利用红外光谱法对中药提取物直接进行分析,可对其主体成分进行初步的识别,为制定下一步的提取方案和检测方法提供了方向性参考。