差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的探讨体外全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,为体外获取纯度较高的骨髓间充质干细胞提供理论基础。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、增殖及细胞形态的变化,并采用MTT法绘制P3代细胞生长曲线。结果全骨髓贴壁法分离出的骨髓间充质干细胞经多次换液及传代后得到形态比较一致的典型的纤维样细胞,细胞呈漩涡样、栅栏样及鱼群样集落式生长,细胞间紧密排列,细胞生长曲线呈近似"S"型。结论全骨髓贴壁法能分离出纯度较高的骨髓间充质干细胞,且能最大限度的保持细胞活力。

体外全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨体外采用全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells,h BMSCs)的可行性,为研究h BMSCs提供实验细胞来源。方法从因创伤导致骨折需行骨折复位及髂骨植骨术的志愿者中,获取骨髓,采用全骨髓贴壁法培养和分离h BMSCs,在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态,取P3代细胞行表型鉴定;取P1、P2、P3代细胞,分别用胰蛋白酶消化,以培养时间为横轴,细胞数量为纵轴,绘制h BMSCs生长曲线图。结果经全骨髓贴壁法培养分离获得了纯度较高的h BMSCs,细胞呈均一的长梭形、短梭形及多角形,漩涡状或辐射状结构,绘制的生长曲线呈S形。P3代h BMSCs经流式细胞鉴定:CD29、CD44、CD90、CD105分别为99.6%、100%、99.4%、92.5%,呈阳性表达;而表达CD34、CD45分别为0.5%、0.6%,呈阴性表达。结论体外应用全骨髓贴壁培养法可成功分离h BMSCs,方法操作简单易行、经济,且能最大限度的保持细胞活力。

体外培养SD大鼠与BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性比较

目的观察SD大鼠和BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外培养情况及生物学特性,评估两种BMMSC分离、纯化及扩增的能力。方法全骨髓法联合差速贴壁培养法分离、纯化及扩增SD大鼠和BALB/c小鼠BMMSC;倒置相差显微镜观察BMMSC原代及第3代细胞形态及生长过程,HE染色观察第3代细胞形态,细胞计数法绘制第3代细胞生长曲线观察细胞增殖情况;流式细胞术检测第3代细胞表面CD29、CD44、CD45、CD34;第3代BMMSC经成骨诱导液诱导3周后,用茜素红染色检测BMMSC的分化能力。结果倒置相差显微镜观察SD大鼠骨髓细胞原代培养的细胞集落形成时间早于BALB/c小鼠,原代及第3代SD-BMMSC集落细胞呈纺锤形,大小较一致,集落形成快且较多,呈鱼群状,而BALB/c-BMMSC较杂,有圆形、三角形或梭形,细胞较小,集落少,呈霜花状; HE染色显示SD-BMMSC集落较BALB/c-BMMSC更为典型,呈鱼群状,细胞形态较为均一;两种BMMSC第3代细胞生长曲线均近似"S"型,但SD-BMMSC增殖能力较好;两种第3代BMMSC经成骨诱导培养3周后,经茜素红染色均可见有矿化结节,但SD-BMMSC形成的矿化结节较明显;第3代两种BMMSC表面标志CD29、CD44均高表达,CD34均低表达,而CD45在SD-BMMSC低表达,在BALB/c-BMMSC高表达。结论全骨髓法联合差速贴壁培养法可成功分离、纯化及扩增SD大鼠和BALB/c小鼠BMMSC,而SD-BMMSC体外分离培养、纯化及扩增更易更快,且获得的BMMSC纯度高。