双重PCR检测携带有tl和tdh基因的副溶血弧菌毒力菌株

在常规PCR技术的基础上优化条件 ,建立并完善双重PCR技术 ,并通过检测阳性对照和待检样品 ,进一步确定其检测的可行性。结果表明在常规PCR方法中为阳性的样品 ,包括阳性对照以及待检样品 ,在双重PCR方法中也呈现阳性 ,为阴性的样品在本方法中则也呈现阴性 ;能在血平板中出现溶血圈的在本法中也被印证含有tdh基因。由此证实本方法确实能对tl和tdh两种基因同时进行检测 ,成功地证明了同时检测tl和tdh两种基因的双重PCR方法的可行性。该法不但具有常规PCR的优点 ,而且还能节省耗材和时间 。

副溶血弧菌TDH的原核表达及单克隆抗体的制备

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构建重组表达质粒p ET-28a-tdh,转入E.coli Rosetta中,在IPTG诱导下进行TDH蛋白表达。为制备耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,用纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功用原核载体表达的TDH蛋白为免疫原,制得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为T9N10。获取腹水并经Ni-NTA Resin亲和柱纯化,其稳定分泌的单克隆抗体经鉴定为Ig G1,相对分子质量约为146 000,并表现出较强的特异性。本研究为开发副溶血弧菌免疫学快速检测和深入的研究奠定良好的物质基础。

结合流式细胞仪检测技术的菌体原位PCR扩增

建立一套原位PCR检测方法 ,联合流式细胞仪作为检测工具 ,作为基因水平转移研究中的基因监控手段。通过常规PCR反应以确定靶基因的基本扩增参数 ;细菌菌体经过多聚甲醛PBS液固定和溶菌酶处理后进行原位PCR扩增 ,产物洗涤后迅速用流式细胞仪进行荧光检测 ,并辅以荧光显微镜镜检。扩增样品在荧光显微镜的蓝光激发下发出明亮的黄绿色荧光 ,与空白对照中的无扩增菌体的自发荧光可明显区分。流式细胞仪检测结果也显示 ,阴性菌与阳性菌的荧光强度有明显区别。完成了对目标细菌的原位PCR扩增 ,并成功地应用流式细胞仪对原位PCR扩增菌体实施了检测。由此表明isPCR

武汉市6起食物中毒副溶血弧菌分子特征研究

目的:了解武汉地区6起食物中毒病原菌副溶血弧菌分子特征。方法:对6起食物中毒共16株分离株进行药敏分析,运用PCR技术进行耐热性溶血毒素基因(tdh)和耐热性溶血毒素相关溶血素基因(trh)检测,并进行肠道细菌重复基因间共同序列PCR(ER IC-PCR)分析。结果:16株副溶血弧菌对第三代头孢和喹诺酮类较敏感,tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR结果显示每起食物中毒菌株亲缘关系非常紧密,有3起属于同一个群,另外2起属于一个群。结论:武汉地区流行的主要副溶血弧菌分子特征为tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR技术是分析副溶血弧菌引起食物中毒菌株非常有效的工具。

副溶血弧菌tdh基因LAMP检测技术的建立

环等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异性、高效、快速地扩增靶基因的DNA扩增技术。根据副溶血弧菌特异性的毒力基因tdh保守序列,本文设计1套特异性引物对该基因进行环等温扩增,同时对反应条件进行优化,建立携带tdh基因的致病性副溶血弧菌的LAMP快速检测技术。结果表明,LAMP最适反应在60.8℃恒温、45min内完成,与其它常见的细菌无交叉反应。LAMP方法的细菌DNA最低检出限为35.5fg/反应管,灵敏度较PCR方法高10倍。对扇贝样品中分离的菌株的检测表明,LAMP方法对检测致病性副溶血弧菌具有良好的可靠性。

磁性荧光纳米颗粒标记免疫层析技术检测副溶血性弧菌热稳定直接溶血素的试验研究

目的通过抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒相结合的免疫层析技术,建立一种快速检测产热稳定直接溶血素(TDH)副溶血性弧菌的方法。方法构建产TDH副溶血性弧菌基因片段并进行扩增,扩增产物与质粒载体(p ET-28a)连接,并在大肠埃希菌中表达,制备抗体。抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒偶联后,制成免疫层析检测试纸条。将混有不同浓度标准菌株样品和阴性对照样品分别与荧光纳米颗粒-单抗偶联物和试纸条共同反应5min,紫外光下肉眼观察结果。对试验的敏感性、特异性、重复性进行测试并进行样品模拟试验。结果重组质粒载体在大肠埃希菌BL21(DE3)可稳定高效地表达分子量为26 k D的可溶形式的目的蛋白,并实现了单克隆抗体与磁性荧光颗粒很好的偶联,所得偶联物与最低浓度10 CFU/ml阳性菌株反应,阴性对照菌株无反应。结论试验制备的产TDH副溶血性弧菌毒力基因表达产物与磁性荧光纳米颗粒有机结合,检测操作过程简单,具有灵敏度高、特异性强、重复性好和检测时间短等特点。

用双功能磁性纳米标记技术检测产热稳定直接溶血素副溶血性弧菌的实验研究

目的通过抗体与磁性荧光纳米颗粒标记的免疫层析技术,建立一种快速检测产热稳定直接溶血素(TDH)副溶血性弧菌的检测方法。方法构建副溶血性弧菌TDH基因片段,将p ET-28a-TDH重组质粒载体转化大肠杆菌表达并制备克隆抗体。抗体与磁性荧光纳米颗粒偶联后,制成免疫层析检测试纸条。将混有不同浓度标准菌株样品与荧光纳米颗粒-单抗偶联物和试纸条共同反应5 min,紫外光下肉眼观察结果。并进行了实验的敏感性、特异性、重复性测试及样品模拟实验。结果转化的重组质粒载体在E.coli BL21(DE3)可稳定高效地表达目的蛋白。并实现了单克隆抗体与磁性荧光颗粒很好的偶联,所得偶联物与阳性菌株反应特异性强、敏感性高,阴性对照菌株无反应。结论实验成功制备了与副溶血性弧菌TDH毒力基因表达产物相结合的磁性荧光纳米颗粒复合物。检测过程操作简单,具有灵敏度高、特异性强、重复性好和检测时间短等特点。